Modified AAV capsid proteins and uses in evading neutralizing antibodies

Abstract

The present disclosure provides modified AAV capsid proteins having reduced binding of serum antibodies, AAV capsid comprising such modified capsid proteins, and AAV vectors comprising such AAV capsids. Methods of using such AAV capsids are also provided.

Description

MODIFIED AAV CAPSID PROTEINS AND USES IN EVADING NEUTRALIZING ANTIBODIESTECHNICAL FIELD

[0001] The present disclosure relates generally to the field of gene therapies, specifically relates to modified adeno-associated virus (AAV) capsid proteins and uses in evading neutralizing antibodies.BACKGROUND

[0002] Recombinant AAV has unique advantages for gene therapy. As an example, one of the most commercially successful drug, Zolgesma developed by Novartis, is based on AAV. In fact, plenty of gene therapy pipelines targeting genetic disorders of the nervous system or muscle tissue are based on AAV. Nevertheless, the presence of neutralizing antibodies greatly limits the application of the therapy, as a result, the instructions for Zolgesma explicitly require that the patient's serum antibody titer be less than 1: 50. If AAV mutants that efficiently escape neutralizing antibodies can be developed, it will greatly increase the scope of application of related gene therapy drugs.

[0003] However, how to efficiently overcome the recognition of neutralizing antibodies against AAV has become a critical challenge. These antibodies can quickly recognize and bind to AAV vectors, preventing them from effectively delivering therapeutic genes into target cells, thereby significantly reducing the effectiveness of the treatment.

[0004] Needs remain for methods of modifying AAV mutants to efficiently evade recognition by multiple neutralizing antibodies during gene therapy.SUMMARY OF INVENTION

[0005] In one respect, the present disclosure provides a modified AAV capsid protein comprising at least one mutated antigenic epitope comprising at least one amino acid mutation at a position selected from the group consisting of 441, 442, 444, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 545, 552, 555, 556, 557, 559, 560, 588 and 715; wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) , and wherein the at least one amino acid mutation substantially reduces binding of serum antibodies to the AAV capsid protein.

[0006] In one aspect, the present disclosure provides a polynucleotide encoding the AAV modified capsid protein as disclosed herein. In one aspect, the present disclosure provides an expression vector comprising the polynucleotide as disclosed herein. In one aspect, the present disclosure provides a cell comprising the polynucleotide or the expression vector as disclosed herein.

[0007] In one aspect, the present disclosure provides an AAV capsid comprising the modified AAV capsid protein as disclosed herein. In one aspect, the present disclosure provides an AAV virus vector comprising the AAV capsid as disclosed herein.

[0008] In one aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the AAV virus vector as disclosed herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0009] In one aspect, the present disclosure provides a method of delivering a cargo nucleic acid to a cell, comprising contacting the cell with the virus vector as disclosed herein.

[0010] In one aspect, the present disclosure provides a method of delivering a cargo nucleic acid to a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the virus vector as disclosed herein or the pharmaceutical composition as disclosed herein.

[0011] In one aspect, the present disclosure provides a method of treating a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the AAV virus vector as disclosed herein or the pharmaceutical composition as disclosed herein.

[0012] In a further aspect, the present disclosure provides a method of producing an AAV vector that evades neutralizing antibodies in a host, comprising, a) inserting a short peptide into a variety of sites in VP3 protein to produce a library of modified AAV vectors; b) determining binding of the modified AAV vectors to a sample containing pooled serum of different subjects; c) identifying the modified AAV vector with reduced binding to the serum sample.

[0013] The foregoing summary is illustrative only and is not intended to be in any way limiting. In addition to the illustrative aspects, embodiments, and features described above, further aspects, embodiments, and features will become apparent by reference to the drawings and the following detailed description. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0014] Fig. 1 shows the mapping of the 122 selected insertion sites on the AAV9 capsids surface. The figure was developed based on the published AAV9 crystal structure (PDB #7MT0 ) using Pymol. The insertion sites were identified in red.

[0015] Fig. 2 shows the results of serum dilutions binding against ELISA plate coated with different concentration of wild type AAV9.

[0016] Fig. 3 shows the ELISA result of mixed serum dilutions binding with wild type AAV9 and 122 AAV9 variants. The reads were ranked from high to low and the signal of wild type AAV9 binding was indicated with label. 20 mutants gave over 50%reduction than the wild type AAV9 in the screening.

[0017] Figs. 4A and 4B show wild type AAV9 and 21 selected variants recognized by 48 individual serum sample at 1: 50 dilution. Fig. 4A shows ELISA results of all the serum antibody bindings for AAV9 variants with insertion at indicated position. Fig. 4B shows the positive rate among the 48 individual serum samples calculated for each AAV9 variants, with ELISA cutoff of 0.9.

[0018] Figs. 5A and 5B show the mapping of the 13 key residuals at which an insertion significantly reducing serum antibody binding. Fig. 5A shows the structure of the whole AAV9 capsid and Fig. 5B shows one subunit of the AAV9 capsid. The figures were developed based on the published AAV9 crystal structure (PDB #7MT0) using Pymol. The key residuals were identified by arrows.

[0019] Fig. 6 shows the transduction inhibition of serum sample on wild type AAV9 (AAV9-wt) and AAV9 variant with Strep-II tag insertion at 509 of VP1 (509-ST) .

[0020] Fig. 7 shows the transduction inhibition of serum sample on wild type AAV9 (AAV9-wt) and AAV9 variants with different type of mutations at position 509 of VP1. 509-S2: insertion of 2 amino acid peptide, 509-S4 insertion of 4 amino acid peptide, 509-S6: insertion of 6 amino acid peptide, 509-Myc: insertion of Myc-tag, 509-GS4 insertion of GGGS, 509-GS8: insertion of GGGSGGGS. 509-RP8: replaced the original sequences at positions 506-513 of VP1 with the strep-II tag sequence WSHPQFES.

[0021] Fig. 8 shows the transduction inhibition of serum sample on wild type AAV9 (AAV9-wt) and AAV9 variants with different type of mutations at position 559 of VP1. 559-ST: insertion of Strep-II tag at position 559 of VP1, 559-Myc insertion of Myc-tag at 559 of VP1.

[0022] Fig. 9 shows the transduction inhibition of serum sample on wild type AAV6 (AAV6-WT) and an AAV6 variant with an insertion at position 512 of VP1. AAV6-ST512: insertion of Strep-II tag at position 512 of VP1.

[0023] Fig. 10 shows the transduction inhibition of serum sample on wild type AAV6 (AAV6-WT) and an AAV6 variant with an insertion at position 513 of VP1. AAV6-ST513: insertion of Strep-II tag at position 513 of VP1.

[0024] Fig. 11 shows the transduction inhibition of serum sample on wild type AAV6 (AAV6-WT) and an AAV6 variant with an insertion at position 556 of VP1. AAV6-ST556: insertion of Strep-II tag at position 556 of VP1.

[0025] Fig. 12 shows the transduction inhibition of serum sample on wild type AAV6 (AAV6-WT) and an AAV6 variant with an insertion at position 557 of VP1. AAV6-ST557: insertion of Strep-II tag at position 557 of VP1.

[0026] Fig. 13 shows the transduction inhibition of serum sample on wild type AAV6 (AAV6-WT) and an AAV6 variant with an insertion at position 559 of VP1. AAV6-ST559: insertion of Strep-II tag at position 559 of VP1.DETAILED DESCRIPTION

[0027] In the following detailed description, reference is to be made to the drawings set forth in the above, which are intended to accompany the various embodiments provided herein and are intended to constitute part of the description for the embodiments. Unless the context indicates or dictates otherwise, similar symbols in the drawings typically identify similar components in the description.

[0028] All of the descriptions as provided herein are merely intended to illustrate the various embodiments of the inventions provided herein, and are not meant to be limiting. It will be apparent to one skilled in the art that various equivalents, changes, and modifications may be made without departing from the scope of the disclosure, and it is understood that such equivalent embodiments are to be included herein.

[0029] It is to be appreciated that certain features of the present disclosure, which are, for clarity, described in the context of separate embodiments, can also be provided in combination in a single embodiment. Conversely, various features of the present disclosure, which are, for brevity, described in the context of a single embodiment, can also be provided separately or in any suitable sub-combination. In order to illustrate, if one specific embodiment disclosed herein includes components A, B and C, it should be understood that the present disclosure also intends to include embodiments which contains A, B or C individually or any combinations of A, B or C.

[0030] All references cited in the present disclosure, including patent applications, issued patents, published articles or other publications, are incorporated by reference in their entirety, which are for the purpose of providing methodologies that might be used in connection with the description provided herein. With respect to any term that is presented in one or more publications that is similar to, or identical with, a term that has been expressly defined in this disclosure, the definition of the term as expressly provided in this present disclosure will control in all respects.

[0031] All technical and scientific terms used, unless expressly defined otherwise, in this present disclosure, are generally deemed to have the same meaning as commonly understood to one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. I. Definitions

[0032] Before detailed description of the inventions in this present disclosure is provided, the following are noted and defined.

[0033] As used herein, i.e., throughout the whole disclosure, the articles “a, ” “an, ” and “the” are to be construed to mean “one or more” or “at least one” unless specified otherwise. By way of example, “a gene” can mean one gene or more than one gene.

[0034] As used herein, unless explicitly indicated otherwise, any number range described herein can include each number within the range and each subrange.

[0035] As used herein, the terms “about, ” “approximately, ” “around” or alike, refer to a quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length that varies by as much as 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1%to a reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length. In particular embodiments, the terms “about” or “approximately” when preceding a numerical value indicates the value plus or minus a range of 15%, 10%, 5%, or 1%.

[0036] As used herein, the term “polypeptide” is used interchangeably to “peptide, ” “protein, ” or alike, and is used to refer to a polymer of amino acid residues, or an assembly of multiple polymers of amino acid residues. The term applies to both a naturally occurring amino acid polymer and a non-naturally occurring amino acid polymer, and is construed to also cover an amino acid polymer in which one or more amino acid residues are artificial or synthetic chemical mimetics of their corresponding naturally occurring amino acids. The term “protein” typically refers to large polypeptides. The term “peptide” typically refers to short polypeptides. Polypeptide sequences are usually described as the left-hand end of a polypeptide sequence is the amino-terminus (N-terminus) , and the right-hand end of a polypeptide sequence is the carboxyl-terminus (C-terminus) .

[0037] As used herein, the term “nucleic acid” refers to oligonucleotides or polynucleotides such as deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) , and by extension, shall also be interpreted to include, as equivalents, derivatives, variants and analogs of RNA or DNA made from nucleotide analogs, single (sense or antisense) and double-stranded polynucleotides. It is to be understood that the term “nucleic acid” does not refer to or infer a specific length of the polynucleotide chain, thus nucleotides, polynucleotides, and oligonucleotides are also included in the definition.

[0038] As used herein, the terms “comprise, ” “comprises, ” “comprising, ” “include, ” “includes, ” “including, ” “contain, ” “contains, ” “containing” , “have, ” “has, ” “having” and the like, are synonymous and are used inclusively, in an open-ended fashion, and do not exclude additional elements, features, steps, acts, operations, and so forth.

[0039] As used herein, the term “or” is used in its inclusive sense (and not in its exclusive sense) so that when used, for example, to connect a list of elements, the term “or” means one, some, or all of the elements in the list.

[0040] As used herein, the phrase “at least one” means one or more, i.e. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or more. A phrase referring to “at least one of” a list of items is construed to refer to any combination of those items, including single members. As an example, “at least one of: A, B, or C” is intended to cover: A, B, C, A and B, A and C, B and C, and A, B, and C. Conjunctive language such as the phrase “at least one of X, Y and Z, ” unless specifically stated otherwise, is otherwise understood with the context as used in general to convey that an item, term, etc. may be at least one of X, Y or Z. Thus, such conjunctive language is not generally intended to imply that certain embodiment requires at least one of X, at least one of Y, and at least one of Z to each be present.

[0041] As used herein, the terms “reduce, ” “reduces, ” “reduction” and similar terms mean a decrease of at least about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 35%, about 50%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 97%or more.

[0042] “Percent (%) sequence identity” with respect to amino acid sequence (or nucleic acid sequence) is defined as the percentage of amino acid (or nucleic acid) residues in a candidate sequence that are identical to the amino acid (or nucleic acid) residues in a reference sequence, after aligning the sequences and, if necessary, introducing gaps, to achieve the maximum correspondence. Alignment for purposes of determining percent amino acid (or nucleic acid) sequence identity can be achieved, for example, using publicly available tools such as BLASTN, BLASTp (available on the website of U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI) , see also, Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol., 215: 403–410 (1990) ; Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25: 3389–3402 (1997) ) , ClustalW2 (available on the website of European Bioinformatics Institute, see also, Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266: 383-402 (1996) ; Larkin M.A. et al, Bioinformatics (Oxford, England) , 23 (21) : 2947-8 (2007) ) , and ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. Those skilled in the art may use the default parameters provided by the tool, or may customize the parameters as appropriate for the alignment, such as for example, by selecting a suitable algorithm. In certain embodiments, the non-identical residue positions may differ by conservative amino acid substitutions.

[0043] As used herein, a “homologue sequence” and “homologous sequence” are used interchangeable and refer to polynucleotide sequences (or its complementary strand) or amino acid sequences that have sequence identity of at least 80% (e.g. at least 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) to another sequences when optionally aligned.

[0044] A “conservative amino acid substitution” is one in which an amino acid residue is substituted by another amino acid residue having a side chain (R group) with similar chemical properties (e.g., charge or hydrophobicity) . In general, a conservative amino acid substitution will not substantially change the functional properties of a protein. In cases where two or more amino acid sequences differ from each other by conservative substitutions, the percent or degree of similarity may be adjusted upwards to correct for the conservative nature of the substitution. Means for making this adjustment are well known to those of skill in the art. See, e.g., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331, which is herein incorporated by reference.

[0045] As used herein, the references “one embodiment, ” “an embodiment, ” “a particular embodiment, ” “a related embodiment, ” “a certain embodiment, ” “an additional embodiment, ” or “a further embodiment” or combinations thereof, are to be understood to mean that a particular feature, structure or characteristic described in connection with this particular embodiment is included in at least one embodiment of the present disclosure. Thus, the presences or appearances of the foregoing phrases in various places throughout this disclosure are not necessarily all referring to the same embodiment. Furthermore, the particular features, structures, or characteristics may be combined in any suitable manner in one or more embodiments.

[0046] Conditional language used herein, such as, among others, “can, ” “could, ” “might, ” “may, ” “e.g., ” and the like, unless stated expressly otherwise, or otherwise understood within the context as used, is generally intended to convey that certain embodiments include, while other embodiments do not include, certain features, elements and / or steps. Thus, such conditional language is not generally intended to imply that features, elements and / or steps are in any way required for one or more embodiments. II. Modified Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Proteins

[0047] The present disclosure provides modified AAV capsid proteins that have substantially reduced binding to serum antibodies, in particular, anti-AAV antibodies or anti-AAV neutralizing antibodies. The present disclosure further provides AAV virus vectors comprising the modified AAV capsid proteins provided herein, such that the AAV virus vectors have substantially reduced binding to serum antibodies, in particular, anti-AAV antibodies or anti-AAV neutralizing antibodies. Such AAV virus vectors provided herein are particularly useful for delivering or expressing a cargo nucleic acid to a subject, for example, for therapeutic use.

[0048] In one aspect, the present disclosure provides a modified AAV capsid protein comprising at least one mutated antigenic epitope. In certain embodiments, the mutated antigenic epitope comprises at least one amino acid mutation (e.g. insertion, substitution, deletion, or any combination thereof) . In certain embodiments, the amino acid mutation is at a position selected from the group consisting of 441, 442, 444, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 545, 552, 555, 556, 557, 559, 560, 588 and 715, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO:1) . The AAV capsid protein can be of any suitable serotype, and the corresponding position can be identified by aligning the amino acid sequence the VP1 protein of the AAV capsid protein with the amino acid sequence of the VP1 protein of the wildtype AAV9. a. Advantages of the Virus Vectors Provided Herein

[0049] The AAV virus vectors provided herein are particularly useful and advantageous than other virus vectors, at least in the following aspects.

[0050] Recombinant AAV or AAV virus vectors provided herein have unique advantages for gene therapy. Firstly, AAV is non-pathogenic to humans, making it a safe vector choice. Secondly, extensive research suggests that AAV genes generally do not integrate into the genome, greatly reducing the potential risks associated with therapy. Moreover, AAV can infect various types of cells, including dividing and non-dividing cells, expanding the scope of gene therapy. Additionally, there are multiple naturally occurring serotypes of AAV, allowing scientists to choose the most suitable serotype based on the type and location of the disease, facilitating the selection or design of gene vectors. Lastly, compared to other viral vectors, AAV can induce relatively weak immune responses, reducing the likelihood of adverse reactions and complications. These unique characteristics make AAV a widely used delivery tool in gene therapy.

[0051] Recombinant AAV or AAV virus vectors provided herein are advantageous in overcoming pre-existing immunity against AAV, which provides an important solution to a long-felt problem.

[0052] Due to the widespread presence of AAV in the natural world, a key challenge in AAV gene therapy is the potential presence of neutralizing antibodies in the patient’s body. These antibodies can quickly recognize and bind to AAV vectors, preventing them from effectively delivering cargo nucleic acids into target cells, thereby significantly reducing the effectiveness of the treatment. This situation arises in patients who already have these antibodies due to previous virus exposure or natural immune responses. It is estimated that 40-70%of individuals in the population have pre-existing neutralizing antibodies against AAV in their serum. For these patients, even if AAV vectors can introduce genes of interest into the body, these genes cannot reach and influence the target cells. The presence of neutralizing antibodies not only creates unpredictable variables in potential gene therapy recipients but also severely hinders the widespread clinical application of AAV therapy. Therefore, prior to conducting AAV therapy, doctors typically need to perform detailed serological tests to determine the presence of neutralizing antibodies that could potentially affect the therapy’s effectiveness and adjust the treatment strategy accordingly.

[0053] In the implementation of AAV gene therapy, the efficiency of neutralizing antibody recognition plays a crucial and decisive role. Therefore, reducing the efficiency of neutralizing antibody recognition of AAV is of clinical significance. If this recognition can be effectively reduced, more AAV vectors can evade attacks from the immune system, allowing more therapeutic genes to successfully enter target cells, significantly improving the effectiveness of gene therapy. This can not only help existing patients achieve better treatment outcomes but also expand the applicability of AAV gene therapy, giving more patients the opportunity to benefit from this innovative treatment approach. Therefore, how to efficiently overcome the recognition of neutralizing antibodies against AAV has been one of the greatest challenges in the AAV gene therapy.

[0054] To address this issue, researchers have conducted a series of engineered modification studies on AAV by introducing mutations that enable it to evade neutralizing antibody recognition. These kinds of AAV mutants are highly pursued in the field of gene therapy because they could change the current treatment paradigm, providing new hope for patients who cannot benefit from gene therapy due to the presence of neutralizing antibodies. Although some early research has made progress, most existing work is based on the binding information between a single monoclonal antibody and AAV. This approach differs significantly from the actual situation: due to the highly diverse repertoire of immune responses in the human B cell lineage, exposure to AAV can generate a wide variety of anti-AAV polyclonal antibodies. Different antibodies may recognize different regions on the surface of AAV, making the strategy of modifying antigenic epitopes for a single anti-AAV antibody ineffective in achieving robust immune evasion. Due to the complexity of serum neutralizing antibodies, currently, no AAV mutants have been developed that can efficiently evade recognition by multiple neutralizing antibodies.

[0055] The modified AAV capsid proteins provided herein solves this problem. Generally, the modified AAV capsid proteins provided herein contain one or more mutations introduced in one or more specific antigenic regions (i.e., antigenic epitope regions) on the surface of the AAV capsid protein, which can reduce the recognition of pre-existing anti-AAV antibodies in a host’s serum, for example, human serum. Particularly, the antigenic epitope regions provided by the present disclosure are unique and effective because the capsid modification sites of the present disclosure were discovered using human serum samples containing various naturally occurring neutralizing antibodies. Modifications of the AAV capsids provided herein can effectively reduce the recognition of multiple neutralizing antibodies naturally existing in human serum.

[0056] Through genetic engineering techniques, inventors introduced peptide insertions at 122 different sites within the CAP9 gene sequence, which encodes AAV9 capsid VP proteins, and according to the crystal structures the 122 insertion sites can effectively cover all the prominent structural features on the virus capsid surface. By introducing these mutations into the CAP gene, 122 different engineered AAV9 variants were obtained, each with a unique peptide insertion at specific site on the capsid surface. By comparing the recognition efficiency of pre-existing antibodies in the mixed sera of multiple adults against these AAV9 mutants, inventors identified 21 critical regions on the surface of the AAV9 capsid, giving over 50%of reduction in pre-existing antibody binding compared to wild-type AAV9. Further analysis showed that mutations at 13 out of the 21 selected positions can efficiently evade recognition by pre-existing antibodies from the majority of tested individual serum samples. Structural changes at these key positions, by insertions or substitution or deletions, can protect AAV’s transduction activity from being neutralized by serum antibodies. b. AAV Capsid Protein

[0057] The present disclosure provides modified AAV capsid proteins that have substantially reduced binding to serum antibodies, in particular, anti-AAV antibodies or anti-AAV neutralizing antibodies.

[0058] As used herein, the term “adeno-associated virus” (AAV) , is a small virus that infects humans and some other primate species. AAV is a type of non-pathogenic single-stranded DNA virus that is common in humans and other mammals. AAV belongs to the family Parvoviridae, genus Dependoparvovirus.

[0059] As used herein, the term “capsid” refers to the protein shell of a virus that encloses the viral nucleic acid. Typically, a capsid comprises several oligomeric structural subunits (i.e. protomers) .

[0060] AAV capsid, which is useful for enclosing genetic materials such as a viral genome, is a 20-sided hollow structure with a diameter of approximately 26nm. It can be visualized as an icosahedron made up of 20 triangles, with every 5 triangles forming a pentagon. There is a five-fold rotational axis between each pair of opposing pentagons, a three-fold rotational axis between each pair of opposing triangles’ centers, and a two-fold rotational axis between each pair of opposing edges’ midpoints. AAV capsid comprises a total of 60 copies of capsid proteins VP1, VP2, and VP3, with a ratio of 5: 5: 50 for these three subunits on each capsid. These subunits are encoded by overlapping sequences within the same open reading frame. Neutralizing antibodies recognize antigenic epitope regions on the virus capsid surface and bind to the AAV.

[0061] In certain embodiments, the AAV capsid proteins provided herein are modified such that they have substantially reduced binding to serum antibodies, for example without limitation, anti-AAV antibodies, or more specifically, anti-AAV neutralizing antibodies.

[0062] As used herein, modified AAV capsid proteins having “substantially reduced binding of serum antibodies” is interpreted to encompass modified AAV capsid protein having at least about 30%less, at least about 40%less, at least about 50%less, at least about 70%less, at least about 80%less, or at least about 90%less binding to serum antibodies, than a non-modified or corresponding wildtype AAV capsid protein, under equivalent assay conditions.

[0063] In certain embodiments, the modified AAV capsid proteins provided herein have no more than 20%, no more than 15%, no more than 10%, no more than 8%, no more than 5%, no more than 2%, or no more than 1%of binding to serum antibodies in a suitable detecting assay as compared to a non-modified or corresponding wildtype AAV capsid protein, under equivalent assay settings.

[0064] In some embodiments, the serum antibodies comprise anti-AAV antibodies. Anti-AAV antibodies can specifically bind to an AAV capsid. In some embodiments, the serum antibodies are capable of binding to the antigenic epitope in the AAV capsid protein provided herein. In some embodiments, the serum antibodies are pre-existing anti-AAV antibodies present in serum of a host, and that are capable of binding to the antigenic epitope in the AAV capsid protein provided herein. In some embodiments, the serum antibodies comprise an IgG (including IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) , IgM, IgE or IgA. In some embodiments, the host is human, canine, feline or equine. In certain embodiments, the host is human.

[0065] In some embodiments, the serum antibodies comprise anti-AAV neutralizing antibodies. The term “anti-AAV neutralizing antibody” as used herein, means antibodies that could effectively inhibit infection of an AAV virus particle to its susceptible host cells (e.g., those cells targeted to be delivered with gene therapy drugs) .

[0066] Various methods are appropriate for assessing how well the modified AAV capsid proteins provided herein bind to serum antibodies. For instance, one can measure this binding by exposing AAV viral particles that display the modified capsid proteins to serum samples containing the serum antibodies. To evaluate the extent of binding reduction, a comparative test can be conducted in parallel using control AAV viral particles that present an equivalent, yet modified capsid proteins. This parallel testing provides a comparison between the modified and original capsid protein’s antibody binding levels.

[0067] As used herein, the term “capsid protein” refers to a structural protein of the capsid of a virus. AAV capsid has three capsid proteins, including viral protein 1 (VP1) , VP2 and VP3, which assemble to the icosahedral capsid. In an AAV genome, VP1, VP2 and VP3 are all encoded by overlapping sequences within one open reading frame. The entire sequence of VP3 is contained within VP2, and all of VP2 is contained within VP1, which has a unique N-terminal (VP1u) domain. Only the common VP3 region is observed in all of the capsid structures of AAV serotypes determined to date, either by cryo-electron microscopy (cryo-EM) and image reconstruction (cryo-reconstruction) or by X-ray crystallography.

[0068] In certain embodiments, the modified AAV capsid proteins provided herein comprise at least one mutated antigenic epitope comprising at least one amino acid mutation.

[0069] As used herein, the term “antigenic epitope” is the part of AAV capsid protein that is recognized and can be bound by antibodies (e.g., neutralizing antibodies) . The antigenic epitope region can be linear or conformational (i.e., including amino acid residues spaced apart) . Detailed analysis of AAV capsid proteins reveals a conserved structural motif, characterized by an eight-stranded β-barrel (strands βB to βI) and an accompanying α-helix (αA) . The antigenic diversity among AAV serotypes primarily arises from the structurally variable regions (VRs) located on surface loops that connect these β-strands. These VRs are pivotal in forming the unique topography of the capsid surface, leading to serotype-specific variations in cellular tropism, tissue transduction efficiencies, and antigenic properties.

[0070] In certain embodiments, the at least one mutated antigenic epitope comprises at least one amino acid mutation at a position selected from the group consisting of positions 441, 442, 444, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 545, 552, 555, 556, 557, 559, 560, 588 and 715, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein. In some embodiments, the antigenic epitope region is at the position selected from positions: 441, 442, 444, 509, 510, 512, 513, 514, 552, 557, 559, 588 and 715, and wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0071] As used herein, the phrase “correspond to” with respect to AAV capsid protein, reflects the correspondence of amino acid residues of a reference capsid protein to the numbered amino acid residues of a standard AAV capsid protein (e.g. wildtype AAV9 VP1 protein) having certain homology to the reference capsid protein. The reference capsid protein and the standard capsid protein can be of different AAV serotypes, and such correspondence can be obtained by, for example, sequence alignment.

[0072] Owing to the high degree of conservation in the capsid amino acid sequence, substantial cross-reactivity of neutralizing antibody has been reported among different AAV serotypes. In this sense, mutation of the corresponding residue on AAV serotypes other than AAV9 may have similar evading effects on the transduction inhibition. Therefore, in the present disclosure, when listing the positions which are introduced with mutations within the antigenic epitope region, it only uses the specific positions in the specific AAV9 VP1 protein (e.g., with the sequence of SEQ ID NO: 1) as the reference or as an example, and it is not intended to specifically limit the mutation positions to the capsid protein of wildtype AAV9.

[0073] In other words, the positions of the amino acid mutations within the antigenic epitope provided by the present disclosure (e.g., positions 441, 442, 444, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 545, 552, 555, 556, 557, 559, 560, 588 and 715 as mentioned above, among others) not only includes the specific positions in AAV9 VP1 protein (with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) , but also includes those corresponding positions in the capsid proteins in the AAV serotypes other than AAV9 VP1, which can be obtained by e.g., sequence alignment. Sequence alignment can be performed by aligning a selected AAV capsid sequence with a reference sequence, such as AAV9 or another AAV serotype, using any suitable computer programs and techniques such as Clustal W, CAP Sequence Assembly, MAP, MEME, and Vector NTI utilities.

[0074] For example, position 441 of AAV9 VP1 protein corresponds to position 440 of AAV2 VP1 protein, position 431 of AAV5 VP1 protein, position 441 of AAV6 VP1 protein and position 443 of AAV8 VP1 protein. Position 512 of AAV9 VP1 protein corresponds to position 511 of AAV2 VP1 protein, position 498 of AAV5 VP1 protein, position 512 of AAV6 VP1 protein and position 514 of AAV8 VP1 protein. Position 559 of AAV9 VP1 protein corresponds to position 558 of AAV2 VP1 protein, position 548 of AAV5 VP1 protein, position 559 of AAV6 VP1 protein and position 561 of AAV8 VP1 protein, to name just a few.

[0075] In some embodiments, the wildtype AAV9 VP1 protein comprises or consists of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1.

[0076] Wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1)

[0077]

[0078] The modified AAV capsid proteins provided herein can be any suitable AAV serotype. In some embodiments, the modified AAV capsid proteins provided herein is of an AAV serotype selected from AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV12, AAV843, AAVbb2, AAVcyS, AAVrh10, AAVrh20, AAVrh39, AAVrh43, AAVrh64, AAVhu37, AAV3B, AAVhu48, AAVhu43, AAVhu44, AAVhu46, AAVhu19, AAVhu20, AAVhu23, AAVhu22, AAVhu24, AAVhu21, AAVhu27, AAVhu28, AAVhu29, AAVhu63, AAVhu64, AAVhu13, AAVhu56, AAVhu57, AAVhu49, AAVhu58, AAVhu34, AAVhu45, AAVhu47, AAVhu51, AAVhu52, AAVhu T41, AAVhu S17, AAVhu T88, AAVhu T71, AAVhu T70, AAVhu T40, AAVhu T32, AAVhu T17, AAVhu LG15, AAVhu9, AAVhu10, AAVhu11, AAVhu53, AAVhu55, AAVhu54, AAVhu7, AAVhu18, AAVhu15, AAVhu16, AAVhu25, AAVhu60, AAVch5, AAVhu3, AAVhu1, AAVhu4, AAVhu2, AAVhu61, AAVrh62, AAVrh48, AAVrh54, AAVrh55, AAVcy2, AAVrh35, AAVrh37, AAVrh36, AAVcy6, AAVcy4, AAVcy3, AAVcy5, AAVrh13, AAVrh38, AAVhu66, AAVhu42, AAVhu67, AAVhu40, AAVhu41, AAVrh40, AAVrh2, AAVbb1, AAVhu17, AAVhu6, AAVrh25, AAVpi2, AAVpi3, AAVrh57, AAVrh50, AAVrh49, AAVhu39, AAVrh58, AAVrh61, AAVrh52, AAVrh53, AAVrh51, AAVhu14, AAVhu31, AAVhu32, AAVrh34, AAVrh33, AAVrh32, Avian AAV ATCC VR-865, Avian AAV strain DA-1 or Bovine AAV.

[0079] Examples of AAV capsid gene sequences and protein sequences can be found in GenBank database, see, GenBank Accession Nos: AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC 001358, NC 001540, AF513851, AF513852, AY530579, AY631965, AY631966; AF063497, AF085716, AF513852, AY530579, AAS99264.1, AY243022, AY243015, AY530560, AY530600, AY530611, AY530628, AY530553, AY530606, AY530583, AY530555, AY530607, AY530580, AY530569, NC 006263, NC 005889, NC 001862, AY530609, AY530581, AY530563, AY530591, AY530562, AY530584, AY530622, AY530601, AY530586, AY243021, AY530570, AY530589, AY530595, AY530572, AY530588, AY530575, AY530565, AY530590, AY530602, AY530566, AY530587, AY530585, AY530564, AY530592, AY530623, AY530574, AY530593, AY530560, AY530594, AY530573, AF513852, AY530624, AY530561, AY242997, AY530625, AY530567, AY530556, AY530578, AY530568, AY530618, AY243020, AY530579, AY530619, AY530596, AY530612, AY243000, AY530597, AY530620, AY242998, AY530598, AY242999, AY530599, AY243016, NC 001729, NC 001401, AY243018, NC 001863, AY530608, AY243019, NC 001829, AY530610, AY243017, AY243001, AY530613, AY243013, AY243002, AY530614, AY243003, AY695378, AY530558, AY530626, AY695376, AY695375, AY530605, AY695374, AY530603, AY530627, AY695373, AY695372, AY530604, AY695371, AY530600, AY695370, AY530559, AY695377, AY243007, AY243023, AY186198, AY629583, NC 004828, AY530629, AY530576, AY243015, AY388617, AY530577, AY530582, AY530615, AY530621, AY530617, AY530557, AY530616 or AY530554.

[0080] In some embodiments, the capsid protein can be modified or chimeric or synthetic. A chimeric capsid comprises portions of two or more capsid sequences. A synthetic capsid comprise synthetic or artificially designed sequence. In some embodiments, the cap gene or the capsid protein is derived from two or more AAV serotypes.

[0081] In some embodiments, the modified AAV capsid proteins provided herein are derived from wild-type or original capsid proteins of an AAV suitable for therapeutic use, for example, without limitation, AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh. 74, AAVrh. 10, and AAVhu. 37 et al. . The exemplary amino acid sequences of the wild-type or original VP1 proteins of the aforementioned AAVs are provided in the below table.

[0082] In some embodiments, the modified AAV capsid proteins provided herein comprises a variant of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 and 69-80, except that the variant includes at least one amino acid mutation at one or more position (s) specified herein. In some embodiments, except for the at least one amino acid mutation at the position (s) specified herein, the modified AAV capsid proteins provided herein have a sequence identity of at least 90%, 95%, or at least 98%to SEQ ID NO: 1 and 69-80 outside the region of the at least one amino acid mutation.

[0083] In some embodiments, the modified AAV capsid proteins provided herein has a sequence identity of at least 90%, 95%, or at least 98%to SEQ ID NO: 1 and 69-80.

[0084] In some embodiment, the amino acid mutation is selected from insertion, substitution, deletion, or any combination thereof.

[0085] As used herein, the term “insertion” refers to the incorporation of at least one amino acid into a predetermined amino acid sequence. While the insertion will usually consist of the insertion of one or two amino acid residues, the present application contemplates larger “peptide insertions” , e.g. insertion of about three to about five or even up to about dozens of amino acid residues. The inserted residue (s) may be naturally occurring or non-naturally occurring. The inserted residue or residues may be “naturally occurring amino acid residues” (i.e., encoded by the genetic code) and selected from the group consisting of: alanine (Ala) ; arginine (Arg) ; asparagine (Asn) ; aspartic acid (Asp) ; cysteine (Cys) ; glutamine (Gln) ; glutamic acid (Glu) ; glycine (Gly) ; histidine (His) ; isoleucine (Ile) : leucine (Leu) ; lysine (Lys) ; methionine (Met) ; phenylalanine (Phe) ; proline (Pro) ; serine (Ser) ; threonine (Thr) ; tryptophan (Trp) ; tyrosine (Tyr) ; and valine (Val) . Insertion of one or more non-naturally occurring amino acid residues is also encompassed by the definition of an insertion herein. A “non-naturally occurring amino acid residue” refers to a residue, other than those naturally occurring amino acid residues listed above, which is able to covalently bind adjacent amino acid residues (s) in a polypeptide chain. Examples of non-naturally occurring amino acid residues include norleucine, ornithine, norvaline, homoserine and other amino acid residue analogues such as those described in Ellman et al. Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991) . To generate such non-naturally occurring amino acid residues, the procedures of Noren et al. Science 244: 182 (1989) and Ellman et al., supra, can be used. Briefly, these procedures involve chemically activating a suppressor tRNA with a non-naturally occurring amino acid residue followed by in vitro transcription and translation of the RNA.

[0086] Unless otherwise defined, the insertion site in the predetermined amino acid sequence is between the carboxyl group (C-terminal) of the residue at the defined mutation position and the amino group (N-terminal) of the residue next to the defined mutation position. For example, when defining that the insertion mutation is at the position 441 corresponding to the sequence of SEQ ID NO: 1, it means that the inserted amino acid (s) is inserted between the residue at the position 441 and the residue at the position 442 correspond to SEQ ID NO: 1.

[0087] As used herein, the term “substitution” refers to the replacement of at least one existing amino acid residue in a predetermined amino acid sequence with another different “replacement” amino acid residue. The replacement residue (s) may be naturally occurring or non-naturally occurring as disclosed above.

[0088] As used herein, the term “deletion” refers to the removal of at least one amino acid residue from a predetermined amino acid sequence.

[0089] In certain embodiments, the antigenic epitope region, to be introduced with the at least one amino acid mutation, is at the position selected from positions: 441, 442, 444, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 545, 552, 555, 556, 557, 559, 560, 588 and 715, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) . In some embodiments, the antigenic epitope region is at the position selected from positions: 441, 442, 444, 509, 510, 512, 513, 514, 552, 557, 559, 588 and 715, and wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0090] In some embodiments, the amino acid mutation comprises one or more mutations at a position selected from the group consisting of positions 509, 510, 512, 513, 514, or any combination thereof, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0091] In some embodiments, the amino acid mutation comprises one or more mutations at a position selected from the group consisting of positions 559, 557, or any combination thereof, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0092] In some embodiments, the amino acid mutation comprises one or more mutations at a position selected from the group consisting of positions 509, 510, 512, 513, 514, 559, 557, or any combination thereof, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0093] In some embodiments, the amino acid mutation comprises a mutation at position 509, a mutation at position 510, and / or a mutation at position 559, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0094] In some embodiments, the amino acid mutation comprises at least one amino acid insertion. In some embodiments, the amino acid mutation comprises an insertion of at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acid residues. In some embodiments, the amino acid mutation comprises an insertion with a length of 2 to 20, 2 to 18, 2 to 16, 2 to 14, 2 to 12, or 2 to 10 amino acid residues. In some embodiments, the insertion is low antigenic, which does not substantially bind to serum neutralizing antibodies.

[0095] In some embodiments, the mutated antigenic epitope comprises an amino acid sequence set forth in Table 1. In certain embodiments, the modified AAV capsid protein provided herein comprises VP1 comprising a mutated antigenic epitope comprising an amino acid sequence set forth in Table 1, wherein each X, Y or Z at each occurrence, independently represents an amino acid residue; each l, m or n at each occurrence, independently represents an integer of 0 to 20, provided that when at least two of l, m and n are present, they are not 0 at the same time, and when only one of l, m and n are present, it is not 0. In other words, (X) l can be null (if l is 0) , one amino acid residue (if l is 1) , or a peptide fragment having a certain amino acid sequence (if l is an integer above 1) . The similar interpretation also applies to (Y) m and (Z) n. Table 1. Exemplary sequences of mutated antigenic epitopes Each X, Y or Z at each occurrence, independently represents an amino acid residue;  each l, m or n at each occurrence, independently represents an integer of 0 to 20, provided that when at least two of l, m and n are present, they are not 0 at the same time, and when only one of l, m and n are present, it is not 0. The underlined residue indicates the residue at the designated position.

[0096] In certain embodiments, the modified AAV capsid protein provided herein comprises VP1 comprising a mutated antigenic epitope comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 81, 36, and 57-68, wherein the one or more mutation is at a position selected from the group consisting of positions 441, 442, and 444, or any combination thereof, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0097] In certain embodiments, the modified AAV capsid protein provided herein comprises VP1 comprising a mutated antigenic epitope comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 16-18, and 37-39, wherein the one or more mutation is at a position selected from the group consisting of positions 509 and 510, or any combination thereof, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0098] In certain embodiments, the modified AAV capsid protein provided herein comprises VP1 comprising a mutated antigenic epitope comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19-25, and 40-46, wherein the one or more mutation is at a position selected from the group consisting of positions 512, 513, and 514, or any combination thereof, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0099] In certain embodiments, the modified AAV capsid protein provided herein comprises VP1 comprising a mutated antigenic epitope comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12, 26 and 47, wherein the one or more mutation is at position 552, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0100] In certain embodiments, the modified AAV capsid protein provided herein comprises VP1 comprising a mutated antigenic epitope comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 13, 27-33, and 48-54, wherein the one or more mutation is at a position selected from the group consisting of positions 556, 557, and 559, or any combination thereof, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0101] In certain embodiments, the modified AAV capsid protein provided herein comprises VP1 comprising a mutated antigenic epitope comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 14, 34, and 55, wherein the one or more mutation is at position 588, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0102] In certain embodiments, the modified AAV capsid protein provided herein comprises VP1 comprising a mutated antigenic epitope comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15, 35, and 56, wherein the one or more mutation is at position 715, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) .

[0103] In some embodiments, the one or more mutations comprise at least one amino acid insertion. In certain embodiments, the modified AAV capsid protein provided herein comprises VP1 comprising a mutated antigenic epitope comprising the amino acid sequence of MNPLID (X) lQ (Y) mYL (Z) nYYLS (SEQ ID NO: 9) , PGASSW (X) lA (Y) mLNGRN (SEQ ID NO: 10) , SWALN (X) lG (Y) mR (Z) nNSLMN (SEQ ID NO: 11) , GTGRDN (X) lVDADK (SEQ ID NO: 12) , DNVDAD (X) lK (Y) mVM (Z) nITNEE (SEQ ID NO: 13) , NHQSAQ (X) lAQAQT (SEQ ID NO: 14) , or NVEFAV (X) lNTEGV (SEQ ID NO: 15) , wherein the X, Y or Z at each occurrence, independently represents an insertion of at least one amino acid residue, each l, m or n at each occurrence, independently represents an integer of 0 to 20, provided that when at least two of l, m and n are present, they are not 0 simultaneously, and when only one of l, m and n is present, it is not 0. In certain embodiments, (X) l can be null (if l is 0) , one amino acid residue (if l is 1) , or a peptide fragment having a certain amino acid sequence (if l is an integer above 1) . The similar interpretation also applies to (Y) m and (Z) n. In certain embodiments, the mutated antigenic epitope comprises only one insertion. In certain embodiments, the only one insertion is at a position selected from the group consisting of 441, 442, 444, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 545, 552, 555, 556, 557, 559, 560, 588 and 715, wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) . In certain embodiments, the insertion is at position 509. In certain embodiments, the insertion is at position 559. In certain embodiments, the insertion is at position 512, 513, 556, 557, or 559.

[0104] In some embodiments, the insertion is a commonly used protein tag (e.g., a protein purification tag) with a length of no more than 20 amino acid residues. In some embodiments, the protein tag is well-established and commercially available, allowing rapid identification of mutant viruses produced. In some embodiments, the protein tag has a uniform polarity and charge properties.

[0105] In some embodiments, the insertion comprises the amino acid sequence of Strep-II tag or fragments thereof. In certain embodiments, the Strep-II tag comprises an amino acid sequence of WSHPQFES (SEQ ID NO: 2) . In some embodiments, the insertion comprises the amino acid sequence of Myc tag or fragments thereof. In certain embodiments , the Myc tag comprises an amino acid sequence of EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 3) .

[0106] In certain embodiments, the insertion comprises a peptide with 2 amino acid residues, e.g., PQ (SEQ ID NO: 4) . In certain embodiments, the insertion comprises a peptide with 4 amino acid residues, e.g., HPQF (SEQ ID NO: 5) . In certain embodiments, the insertion comprises a peptide with 6 amino acid residues, e.g., SHPQFE (SEQ ID NO: 6) . In certain embodiments, the insertion comprises unrelated sequences including GGGS (SEQ ID NO: 7) , and GGGSGGGS (SEQ ID NO: 8) .

[0107] In some embodiments, the amino acid mutation can be substitution of a region in the AAV capsid protein with a different peptide sequence. In some embodiments, the different peptide sequence for substitution comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2-8, or fragments thereof. In some embodiments, the different peptide sequence for substitution is a protein tag (e.g., a protein purification tag) with a length of no more than 20 amino acid residues. In some embodiments, the protein tag is well-established and commercially available, allowing rapid identification of mutant viruses produced. In some embodiments, the protein tag has a uniform polarity and charge properties. In certain embodiments, the protein tag is a Strep-II tag or fragments thereof. In certain embodiments, the Strep-II tag comprises an amino acid sequence of WSHPQFES (SEQ ID NO: 2) . In some embodiments, the protein tag is a Myc tag or fragments thereof. In certain embodiments, the Myc tag comprises an amino acid sequence of EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 3) .

[0108] In certain embodiments, the amino acid mutation comprises or is an insertion of Strep-II tag, e.g., comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, at position selected from positions 441, 442, 444, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 545, 552, 555, 556, 557, 559, 560, 588 and 715 of wildtype AAV9 VP1 protein SEQ ID NO: 1. In certain embodiments, the amino acid mutation comprises or is an insertion of Strep-II tag, e.g., comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, at position selected from positions 441, 442, 444, 509, 510, 512, 513, 514, 552, 557, 559, 588 and 715 of wildtype AAV9 VP1 protein SEQ ID NO: 1.

[0109] In certain embodiments, the amino acid mutation comprises or is an insertion of an amino acid sequence comprising any one of SEQ ID NOs: 2-9, at the position 509 or 559 of wildtype AAV9 VP1 protein SEQ ID NO: 1.

[0110] In certain embodiments, the amino acid mutation comprises or is a substitution of positions 506-513 wildtype AAV9 VP1 protein SEQ ID NO: 1, by the Strep-II tag, e.g., comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. c. Polynucleotide, Expression Vectors, Cells and Virus Vectors

[0111] In one aspect, the present disclosure provides polynucleotides encoding the modified AAV capsid proteins disclosed herein. Further provided are expression vectors comprising the polynucleotide, and cells (in vivo or in culture) comprising the polynucleotide and / or expression vectors of the disclosure.

[0112] In one aspect, the present disclosure provides an AAV capsid, which comprises the modified AAV capsid protein provided herein.

[0113] In one aspect, the present disclosure provides a virus vector, which comprises the AAV capsid provided herein. In certain embodiments, the virus vector provided herein further comprises a nucleic acid comprising at least one terminal repeat sequence, wherein the nucleic acid is encapsidated by the AAV capsid provided herein.

[0114] As used herein, an “virus vector” refers to a nucleic acid vector comprising a nucleic acid having a 5’ viral terminal repeat (TR) and / or 3’ viral terminal repeat sequences. A virus vector can comprise a pair of TRs or a single TR.

[0115] The term “terminal repeat” or “TR” includes any viral terminal repeat or synthetic sequence that forms a hairpin structure and mediates the desired functions such as replication, virus packaging, integration and / or provirus rescue, and the like. For example, the 5’ viral terminal repeat and 3’ viral terminal repeat sequences can contain originals of replication, and allow for DNA synthesis initiation at one of the viral terminal repeat and proceeds to the other viral terminal repeat. Examples of viral terminal repeats include but are not limited to, inverted terminal repeats (ITR) (for example, those includes in the adeno-associated virus (AAV) ) , long terminal repeats (LTR) (for example, those included in the retrovirus) etc.

[0116] In certain embodiments, the virus vector comprises an AAV virus vector. In certain embodiments, the virus vector of the present disclosure comprises at least one ITR of AAV. The ITRs sequences of AAV is capable of guiding replication and packaging of the viral vector genome.

[0117] An AAV ITR can be derived from any AAV, including but not limited to AAV serotype 1 (AAV 1) , AAV 2, AAV 3, AAV 4, AAV 5, AAV 6, AAV 7, AAV 8, AAV 9, AAV 10, AAV 11, AAV 12, avian AAV, bovine AAV, canine AAV, equine AAV, and ovine AAV and any other AAV now known or later discovered. For details please see, e.g., BERNARD NF et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers) , Gao et al., (2004) J. Virol. 78: 6381-6388. The nucleotide sequences of AAV ITR regions are known. See for example, Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Berns, K. I. “Parvoviridae and their Replication” in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. ) .

[0118] An AAV ITR can be native AAV ITR, or alternatively can be altered from a native AAV ITR, for example by mutation, deletion or insertion, so long as the altered ITR can still mediate the desired biological functions such as replication, virus packaging, integration, and the like. The 5’a nd 3’ ITRs which flank a selected nucleotide sequence in an AAV vector need not necessarily be identical or derived from the same AAV serotype, so long as they function as intended, for example, to allow for excision and rescue of the sequence of interest from and integration into the recipient cell genome.

[0119] In certain embodiments, the virus vector comprises at least part of the AAV genome. In certain embodiments, the virus vector lacks the REP and CAP genes within an AAV genome.

[0120] In some embodiments, the nucleic acid further comprises a cargo nucleic acid operably linked to the at least one terminal repeat sequence. In certain embodiments, the viral vector can comprise at the 5’ end of the TR or ITR, and / or at the 3’ end of the TR or ITR, or between the TRs or ITRs, one or more cargo nucleic acids that are heterologous to the viral genome. In certain embodiments, the cargo nucleic acid replaces the REP and CAP genes originally present in the AAV genome.

[0121] In some embodiments, the cargo nucleic acid encodes a therapeutic protein or RNA.

[0122] The cargo nucleic acid sequence delivered in the virus vectors of the present disclosure may be any heterologous nucleic acid sequence (s) of interest. Nucleic acids of interest include nucleic acids encoding polypeptides, including therapeutic (e.g., for medical or veterinary uses) or immunogenic (e.g., for vaccines) polypeptides or functional RNAs.

[0123] Optionally, the cargo nucleic acid encodes a secreted polypeptide (e.g., a polypeptide that is a secreted polypeptide in its native state or that has been engineered to be secreted, for example, by operable association with a secretory signal sequence as is known in the art) .

[0124] Alternatively, the cargo nucleic acid provided herein may encode an antisense nucleic acid, a ribozyme (e.g., as described in U. S. Pat. No. 5, 877, 022) , RNAs that effect spliceosome-mediated / ram-splicing, interfering RNAs (RNAi) including siRNA, shRNA or miRNA that mediate gene silencing, and other non-translated RNAs, such as guide RNAs, and the like. Exemplary untranslated RNAs include RNAi against PCSK9 mRNA, RNAi against transthyretin mRNA, RNAi against a multiple drug resistance (MDR) mRNA (e.g., to treat and / or prevent tumors and / or for administration to the heart to prevent damage by chemotherapy) , RNAi against myostatin mRNA (e.g., for Duchenne muscular dystrophy) , RNAi against VEGF mRNA (e.g., to treat and / or prevent tumors) , RNAi against phospholamban mRNA (e.g., to treat cardiovascular disease) ; phospholamban inhibitory or dominant-negative molecules such as phospholamban S 16E (e.g., to treat cardiovascular disease) , RNAi to adenosine kinase (e.g., for epilepsy) , and RNAi directed against pathogenic organisms and viruses (e.g., hepatitis B and / or C virus, human immunodeficiency virus, CMV, herpes simplex virus, human papilloma virus, etc. ) .

[0125] In some embodiments, the cargo nucleic acid provided herein can comprise a nucleic acid sequence that directs gene editing. For example, the nucleic acid may encode a guide RNA. In some embodiments, the guide RNA is a single guide RNA (sgRNA) comprising a crRNA sequence and a tracrRNA sequence. In some embodiments, the cargo nucleic acid provided herein may encode a nuclease. In some embodiments, the nuclease is a zinc-finger nuclease, a homing endonuclease, a TALEN (transcription activator-like effector nuclease) , a NgAgo (agronaute endonuclease) , a SGN (structure-guided endonuclease) , a RGN (RNA-guided nuclease) , or modified or truncated variants thereof. In some embodiments, the RNA-guided nuclease is a Cas9 nuclease, a Cas12 (a) nuclease (Cpf1) , a Cas12b nuclease, a Cas12c nuclease, a TrpB-like nuclease, a Cas13a nuclease (C2c2) , a Cas13b nuclease, or modified or truncated variants thereof. In some embodiments, the Cas9 nuclease is isolated or derived from S. pyogenes or S. aureus.

[0126] In some embodiments, the cargo nucleic acid provided herein can encode an immunogenic polypeptide, e.g., useful for vaccination. An immunogenic polypeptide can be any polypeptide suitable for eliciting an immune response and / or protecting the subject against an infection and / or disease, including, but not limited to, microbial, bacterial, protozoal, parasitic, fungal and / or viral infections and diseases. Alternatively, the immunogenic polypeptide can be any tumor or cancer cell antigen. Optionally, the tumor or cancer antigen is expressed on the surface of the cancer cell. The nucleic acid may encode any immunogen of interest known in the art including, but not limited to, immunogens from human immunodeficiency virus (HIV) , HPV, simian immunodeficiency virus (SIV) , influenza virus, HIV or SIV gag proteins, tumor antigens, cancer antigens, bacterial antigens, viral antigens, and the like.

[0127] AAV vectors can be constructed using methods known in the art. General principles of rAAV vector construction are known in the art. See, e.g., Carter, 1992, Current Opinion in Biotechnology, 3: 533-539; and Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-129. For example, a cargo nucleic acid can be directly inserted between the ITRs of an AAV genome in which the Rep gene and / or Cap gene have been deleted. Other portions of the AAV genome can also be deleted, so long as a sufficient portion of the ITRs remain to allow for replication and packaging functions. Such constructs can be designed using techniques well known in the art. See, e.g., U.S. Pat. Nos. 5,173,414 and 5,139,941; International Publication Nos. WO 92 / 01070 (published Jan. 23, 1992) and WO 93 / 03769 (published Mar. 4 1993) ; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8: 3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press) ; Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1: 165-169; and Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 1867-1875. Alternatively, AAV ITRs can be excised from the viral genome or from an AAV vector containing the same, and fused to 5’ and 3’ of a cargo nucleic acid using standard ligation techniques.

[0128] In certain embodiments, the AAV virus vector of the present disclosure can also encompass AAV virus particles. A “virus particle” as used herein means a viral genome packaged within a viral capsid. The viral genome in the virus particle can be a modified viral genome such that it may lack some of the native viral sequences and / or may contain some sequences heterologous to the native viral genome. AAV virus particles can be produced by introducing an AAV expression vector into a suitable host cell using known techniques, such as by transfection, together with other necessary machineries such as plasmids encoding AAV cap / rep gene, and helper genes provided by either adeno or herpes viruses (see, for example, M.F. Naso et al, BioDrugs, 31 (4) : 317-334 (2017) , which are incorporated herein to its entirety) . The AAV expression vector can be expressed in the host cell and packaged into virus particles.

[0129] The cargo nucleic acid can further comprise one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid encoding the therapeutic protein or RNA. The term “operably linked” as used herein means that the encoding sequence is directly or indirectly linked to or associated with one or more regulatory sequences in the exogenous nucleic acid, in a manner that allows expression of the protein of interest from the encoding sequence in the cell. The encoding sequence together with the regulatory sequences can be referred to herein as an expression cassette. In certain embodiments, the exogenous nucleic acid can be in the form of an expression vector. Example of transcription regulatory elements include, one or more promoters and / or enhancers and, optionally, a polyadenylation sequence and / or one or more introns inserted between exons of the protein-coding sequence.

[0130] The term “regulatory sequence” as used herein refers to any nucleotide sequence that is necessary or advantageous for the expression of an encoding sequence. A regulatory sequence may include, but is not limited to, one or more promoters, enhancers, transcription terminators, polyadenylation sequences, internal ribosome entry sites, and / or one or more introns inserted between exons of the protein-coding sequence. d. Methods of Producing the Virus Vectors

[0131] The present disclosure further provides methods of producing the virus vectors provided herein.

[0132] In one embodiment, the present disclosure provides a method of producing a virus vector, the method comprising providing to a cell: (a) a nucleic acid comprising at least one TR sequence (e.g., AAV TR sequence) , and (b) AAV sequences sufficient for replication of the nucleic acid template and encapsulation into AAV capsids (e.g., AAV rep sequences and AAV cap sequences encoding the AAV capsids of the disclosure) . Optionally, the nucleic acid further comprises at least one cargo nucleic acid. In particular embodiments, the nucleic acid comprises two AAV ITR sequences, which are located 5’ and 3’ to the cargo nucleic acid (if present) , although they need not be directly contiguous thereto.

[0133] The nucleic acid and AAV rep and cap sequences are provided under conditions such that virus vector comprising the nucleic acid packaged within the AAV capsid is produced in the cell. The method can further comprise the step of collecting the virus vector from the cell. The virus vector can be collected from the medium and / or by lysing the cells.

[0134] In one embodiment, the present disclosure provides a method of producing a virus vector that evades pre-existing anti-AAV antibodies in host serum, comprising : a) introducing at least one amino acid mutation on an AAV capsid protein; b) detecting the binding of the mutated AAV capsid protein to serum antibodies in the host serum; and c) selecting the at least one amino acid mutation in the AAV capsid protein that decreases its binding affinity to the serum antibodies compared to the non-mutated counterpart AAV capsid protein.

[0135] In some embodiments, the anti-AAV antibodies comprise anti-AAV neutralizing antibodies, and the methods further comprise: d) producing an AAV particle comprising the mutated AAV capsid protein selected in step (c) ; e) determining infectivity of the AAV particle to a suitable host cell in the presence of the serum antibodies; and f) selecting the at least one amino acid mutation in the AAV capsid protein that increases infectivity of the AAV particle to the host cell in the presence of the serum antibodies compared to the AAV particle comprising non-mutated counterpart AAV capsid protein.

[0136] In some embodiments, the step e) comprises: (i) contacting the AAV particles of (d) with a suitable host cell under conditions whereby infection and replication can occur; (ii) selecting AAV particles that can complete at least one infectious cycle and replicate to titers similar to control AAV particles; (iii) contacting the AAV particles selected in (ii) with anti-AAV neutralizing serum antibodies and the suitable host cell under conditions whereby infection and replication can occur; and (iv) selecting AAV particles that are not neutralized by the anti-AAV neutralizing serum antibodies of (iii) . This comprehensive approach presents a platform technology that can be applied to modifying any AAV capsid. Application of this platform technology yields AAV antigenic variants derived from the original AAV capsid template without loss of transduction efficiency. Exemplary methods can be found in, for example, Cecchini. S et al. (2008) Gene Ther. 15 (11) : 823-30; Ayuso E et al. (2010) Curr Gene Ther. 10 (6) : 423-36; Kotin RM et al. (2011) Hum Mol Genet 20 (R1) : R2-6; Wright JF et al. (2009) Hum Gene Ther. 20 (7) : 698-706. III. Methods of Delivering Cargo Nucleic Acids to Cells and Subjects

[0137] The virus vectors of the present disclosure are useful for the delivery of nucleic acids to cells in vitro, ex vivo , and in vivo. In particular, the virus vectors can be advantageously employed to deliver or transfer nucleic acids to animal, including mammalian cells. Thus, in some embodiments, a nucleic acid ( “cargo nucleic acid” ) may be encapsulated by a modified capsid protein of the disclosure.

[0138] In general, the virus vectors of the present disclosure can be employed to deliver a cargo nucleic acid encoding a polypeptide or functional RNA to treat and / or prevent any disease state for which it is beneficial to deliver a therapeutic polypeptide or functional RNA. In some embodiments, the virus vectors of the present disclosure can be employed to deliver a cargo nucleic acid encoding a polypeptide or functional RNA to treat and / or prevent a disease or disorder. The disease or disorder includes, but not limited to, genetic diseases, hematological diseases, infectious diseases, neurological diseases, auto-immune diseases, inflammation diseases, metabolic diseases, muscular system diseases, and pancreat, kidney, liver, heart or other specific tissue related diseases.

[0139] The virus vectors according to the present disclosure provide a means for delivering cargo nucleic acids into a broad range of cells, including dividing and non-dividing cells in vivo. The virus vectors can also be employed to deliver a nucleic acid of interest to a cell in vitro, e.g., to produce a polypeptide in vitro or for ex vivo gene therapy. The virus vectors are additionally useful in a method of delivering a nucleic acid to a subject in need thereof e.g., to express an immunogenic or therapeutic polypeptide or a functional RNA. In this manner, the polypeptide or functional RNA can be produced in vivo in the subject. The subject can be in need of the polypeptide because the subject has a deficiency of the polypeptide. Further, the method can be practiced because the production of the polypeptide or functional RNA in the subject may impart some beneficial effect.

[0140] As used herein and in the broadest sense, the term “administer” , “administering” or “administration” , refers to giving or dispensing a pharmaceutically active material to a subject in a pharmacologically compatible manner. The term is intended to include “causing to be administered” , which means causing, urging, encouraging, aiding, inducing or directing, directly or indirectly, another party to administer the pharmaceutically active material to the subject. It is noted that in certain embodiments the term is also exchangeable to “deliver” , “delivery” , “delivering” , or alike. As used herein, the pharmaceutically active material comprises a vehicle (i.e. the inducer vehicle and / or the target vehicle) .

[0141] Exemplary modes of administration include oral, rectal, transmucosal, intranasal, inhalation (e.g., via an aerosol) , buccal (e.g., sublingual) , vaginal, intrathecal, intraocular, transdermal, in utero (or in ovo) , parenteral (e.g., intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular (including administration to skeletal, diaphragm and / or cardiac muscle) , intradermal, intrapleural, intracerebral, and intraarticular) , topical (e.g., to both skin and mucosal surfaces, including airway surfaces, and transdermal administration) , intralymphatic, and the like, as well as direct tissue or organ injection (e.g., to liver, skeletal muscle, cardiac muscle, diaphragm muscle or brain) . Administration can also be to a tumor (e.g., in or near a tumor or a lymph node) . The most suitable route in any given case will depend on the nature and severity of the condition being treated and / or prevented and on the nature of the particular vector that is being used.

[0142] Dosages of the virus vector and / or capsid to be administered to a subject depend upon the mode of administration, the disease or condition to be treated and / or prevented, the individual subject's condition, the particular virus vector or capsid, and the nucleic acid to be delivered, and the like, and can be determined in a routine manner. Exemplary doses for achieving therapeutic effects are titers of at least about 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 transducing units per kilogram body weight, optionally about 108-1013 transducing units per kilogram body weight.

[0143] In particular embodiments, more than one administration (e.g., two, three, four or more administrations) may be employed to achieve the desired level of gene expression over a period of various intervals, e.g., daily, weekly, monthly, yearly, etc.

[0144] As used herein, the term “subject” includes human and non-human animals. Non-human animals include all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as non-human primates, mice, rats, cats, rabbits, sheep, dogs, cows, chickens, amphibians, and reptiles. Except when noted, the terms “patient” or “subject” are used herein interchangeably. In certain embodiments, the subject is human. In some embodiments, the subject is a non-human primate.

[0145] The virus vectors provided herein are advantageous in that they expand the cohort of subjects eligible for gene therapy with AAV vectors. In particular, the virus vectors provided herein can be administered to subjects having a relatively high level of anti-AAV serum antibodies (e.g. anti-AAV neutralizing antibodies) , who are otherwise not eligible for gene therapy with AAV vectors.

[0146] In some embodiments, the subject has a serum antibody titer against AAV (e.g. AAV9) of no more than 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, or 500, , and wherein the antibody titer is defined as fold dilution of the serum of the subject to produce a threshold specific binding to the AAV (e.g. AAV9) capsid protein.

[0147] Binding to the AAV capsid protein can optionally be measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . In some embodiments, the threshold specific binding is determined based on the antibody binding in the presence of a given amount of the AAV capsid protein, where the threshold specific binding is considered as a level of antibody binding sufficient to show specific binding to the AAV capsid protein.

[0148] In some embodiments, the subject has a serum antibody titer against AAV9 of no more than 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, or 500, and wherein the antibody titer is defined as fold dilution of the serum of the subject to give a 50%of maximal neutralization to the AAV9 capsid protein. Neutralization of the AAV9 can optionally be measured by a reporter assay.

[0149] The term “neutralizing antibody titer” means a value reflecting the neutralizing efficiency of the serum comprising at least one neutralizing antibodies. Neutralizing antibody titers of serum can be analyzed by assessing the ability of a serum antibody to inhibit transduction or infection the AAV virus particle into susceptible host cells, where the AAV virus particle can express a reporter gene such as beta-galactosidase or luciferase, following transduction or infection. Neutralizing antibody titers can be determined by fold dilution of the serum to produce about 50%of maximal neutralization to the AAV virus particle, optionally present at a given amount. IV. Pharmaceutical Compositions

[0150] In a further aspect, a pharmaceutical composition is provided comprising a virus vector and / or capsid and / or capsid protein of the disclosure in a pharmaceutically acceptable carrier and, optionally, other medicinal agents, pharmaceutical agents, stabilizing agents, buffers, carriers, adjuvants, diluents, etc.

[0151] As used herein and in a broadest sense, the term “pharmaceutical composition” refers to a preparation comprising a therapeutically effective amount of a pharmaceutically active ingredient, and optionally together with pharmaceutically acceptable excipients and / or carriers, etc. The term "pharmaceutically acceptable" as used herein means suited for normal pharmaceutical applications, i.e.giving rise to no serious side effects such as adverse events in subjects. The term “therapeutically effective amount” , or "effective amount" as used herein means a dosage which is sufficient in order for the treatment of the patient to be effective compared with no treatment. As used herein, “effective amount” refers to an amount that brings about a desired effect, such as an amount capable of treating or ameliorating a disease or condition or otherwise capable of producing an intended therapeutic effect (e.g. inducing immunotolerance) .

[0152] The pharmaceutically active ingredient typically requires one or more pharmaceutically acceptable carriers or excipients to thereby take a suitable form (i.e. pharmaceutical compositions) and dosage form, in order for the effective administration to subject. As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" refers to a carrier or a diluent that does not cause significant irritation to an organism and does not abrogate the biological activity and properties of the administered pharmaceutically active agent. Herein the term "pharmaceutically acceptable excipient" refers to an inert substance added to a pharmaceutical composition to further facilitate administration of the pharmaceutically active ingredient.

[0153] Herein, pharmaceutical compositions suitable for use include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. In all cases, the composition must be sterile and stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi.

[0154] A pharmaceutically acceptable carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like) , and suitable mixtures thereof. For intravenous administration, for example, suitable carriers may include physiological saline, bacteriostatic water, or phosphate buffered saline (PBS) . The proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants. Prevention of the action of microorganisms can be achieved by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols such as manitol, sorbitol, sodium chloride in the composition. Prolonged absorption of the internal compositions can be brought about by including in the composition an agent which delays absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.

[0155] Pharmaceutical compositions may comprise, but are not limited to, solutions, emulsions, and liposome-containing formulations. These compositions may be generated from a variety of components that comprise, but are not limited to, preformed liquids, self-emulsifying solids and self-emulsifying semisolids.

[0156] In some embodiments, the pharmaceutical composition provided herein comprise a therapeutically effective amount of virions in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient, for example saline, phosphate buffered saline, phosphate and amino acids, polymers, polyols, sugar, buffers, preservatives and other proteins. Exemplary amino acids, polymers and sugars and the like are octylphenoxy polyethoxy ethanol compounds, polyethylene glycol monostearate compounds, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sucrose, fructose, dextrose, maltose, glucose, mannitol, dextran, sorbitol, inositol, galactitol, xylitol, lactose, trehalose, bovine or human serum albumin, citrate, acetate, Ringer's and Hank's solutions, cysteine, arginine, carnitine, alanine, glycine, lysine, valine, leucine, polyvinylpyrrolidone, polyethylene and glycol. In certain embodiments, this formulation is stable for at least six months at 4℃.

[0157] In some cases, the unit dose of the pharmaceutical composition of the disclosure may be measured as pfu (plaque forming units) . In some cases, the pfu of the unit dose of the pharmaceutical composition of the disclosure comprising the modified AAV may be above 1×108 to about 1×1015 pfu.

[0158] Compositions provided herein may comprise inorganic or organic buffers (e.g., sodium or potassium salts of phosphate, carbonate, acetate, or citrate) and pH adjustment agents (e.g., hydrochloric acid, sodium or potassium hydroxide, salts of citrate or acetate, amino acids and their salts) antioxidants (e.g., ascorbic acid, alpha-tocopherol) , surfactants (e.g., polysorbate 20, polysorbate 80, polyoxyethylene9-10 nonyl phenol, sodium desoxycholate) , solution and / or cryo / lyo stabilizers (e.g., sucrose, lactose, mannitol, trehalose) , osmotic adjustment agents (e.g., salts or sugars) , antibacterial agents (e.g., benzoic acid, phenol, gentamicin) , antifoaming agents (e.g., polydimethylsilozone) , preservatives (e.g., thimerosal, 2-phenoxyethanol, EDTA) , polymeric stabilizers and viscosity-adjustment agents (e.g., polyvinylpyrrolidone, poloxamer 488, carboxymethylcellulose) and co-solvents (e.g., glycerol, polyethylene glycol, ethanol) .

[0159] Compositions according to the invention may comprise pharmaceutically acceptable excipients. The compositions may be made using conventional pharmaceutical manufacturing and compounding techniques to arrive at useful dosage forms. Techniques suitable for use in practicing the present invention may be found in Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, Edited by Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng, and Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley &Sons, Inc.; and Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, 2nd Ed. Edited by M.E. Auten, 2001, Churchill Livingstone. In an embodiment, compositions are in a sterile saline solution for injection together with a preservative.

[0160] In the following, one example is provided as one specific embodiment of the methods and kits provided in the present disclosure. It is of note that the example is for illustration purpose only and does not limit the scope of the present disclosure. EXAMPLES Example 1. Design and Construction of Insertion Mutations in AAV9 Capsid  Proteins

[0161] The AAV capsid, used for enclosing recombinant genes, is a 20-sided hollow structure with a diameter of approximately 26nm. It can be visualized as an icosahedron made up of 20 triangles, with every 5 triangles forming a pentagon. There is a five-fold rotational axis between each pair of opposing pentagons, a three-fold rotational axis between each pair of opposing triangles'centers, and a two-fold rotational axis between each pair of opposing edges'midpoints. This capsid comprises a total of 60 copies of capsid proteins VP1, VP2, and VP3, with a ratio of 5: 5: 50 for these three subunits on each capsid. These subunits are encoded by overlapping sequences within the same open reading frame. Neutralizing antibodies recognize antigenic epitopes on the virus capsid surface and bind to the AAV. On one hand, antibody binding disrupts the recognition of AAV by cell surface receptors, inhibiting AAV from infecting the target cells. On the other hand, antibody binding leads to the clearance of AAV particles by the body's immune system, further reducing the effectiveness of AAV gene therapy. In certain situations, the neutralization can even block the uncoating process after AAV get into the cell, which impedes successful expression of the therapeutic gene.

[0162] The first challenge in modifying AAV capsid to evade neutralizing antibodies is identifying the major antigenic epitopes that are recognized by these antibodies. To determine the key regions on the AAV capsid surface involved in serum antibody recognition, we used genetic recombination techniques to introduce peptide insertions at 122 different sites within the CAP9 gene sequence, which encodes AAV9 capsid VP proteins. Considering that VP1, VP2, and VP3 proteins are all encoded by overlapping sequences within the same open reading frame, with VP3 contained within VP1 and VP2, and VP3 being the primary structure responsible for assembling the icosahedral capsid, we selected insertion mutation sites within the region encoding VP3 protein. By introducing these mutations into the CAP gene, we obtained 122 different engineered AAV9 variants, each with a unique peptide insertion at specific site on the capsid surface. Based on published AAV9 crystal structures (PDB #7MT0) , the insertion sites we selected can effectively cover all the prominent structural features on the virus capsid surface, enabling systematic disruption of all the potential antigenic epitopes (highlighted in red in Fig. 1) .

[0163] Another challenge in modifying AAV capsid to evade neutralizing antibodies is employing appropriate mutations to disrupt the antigenic epitopes recognized by pre-existing antibodies. In theory, either substitutions or insertions within critical antigenic epitopes could disrupt antibody recognition. However, insertion mutations are more suitable for systematic screening due to their simplicity in generation and significant impact on capsid structure. In the initial screening, we selected StrepII, the commonly used protein purification tag, as the peptide sequence for insertion at the 122 sites. This choice was based on two considerations: first, StrepII-tag related detection tools, including probes and antibodies, are well-established and commercially available, allowing rapid identification of mutant viruses produced; second, compared to other commonly used peptide protein tags, StrepII-tag is shorter in length, and its polarity and charge properties are relatively uniform. In theory, its insertion is expected to have a lower impact on the overall structure of AAV capsid than other commonly used protein tags. Example 2. Screening for Mutations that Evade Serum Antibodies Binding

[0164] Due to the highly diverse spectrum of immune responses in the B cell lineage of human being, different individuals produce varied anti-AAV antibodies when exposed to the virus. In order to identify engineered AAV mutants capable of evading a broad range of neutralizing antibodies, we created a serum mixture by equally mixing peripheral blood sera from four adult individuals. This mixture served as the screening sample, and its binding to the 122 AAV9 mutants with peptide insertions at different sites was tested.

[0165] Various methods are available for measuring AAV neutralizing antibodies in serum. In order to achieve both sensitivity and throughput, we used the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect the binding of AAV9 variants to human IgG antibodies in the mixed serum. To establish proper ELISA reaction conditions, we initially coated ELISA plates with wild-type AAV9 at different concentrations and then incubated these plates with diluted mixed serum at varying concentrations. Detection was performed using an HRP-labeled anti-human IgG secondary antibody to evaluate human serum antibodies bound to wild-type AAV9 (Fig. 2) .

[0166] The results indicated that AAV9 concentrations between 5E9 and 2E10 vg / ml that coated on ELISA plates had minimal influence on ELISA readings, suggesting that AAV within this concentration range effectively covered the bottom of the Nunc MaxiSorp ELISA plates used. Higher virus concentrations did not bind significantly more antibodies. Based on the results of this preliminary experiment, we determined the AAV9 concentration (5E9 vg / ml) and serum dilution factor (50-fold) for the formal screening experiment. Under these conditions, we screened for AAV9 mutants capable of evading neutralizing antibodies of the mixed serum.

[0167] In the screening experiment, we coated ELISA plates with wild-type AAV9 and the 122 different AAV9 variants, respectively, at a concentration of 5E9 vg / ml and then incubated them with the 50-fold diluted sera mixture. Binding of the pre-existing antibodies was detected using an HRP-labeled anti-human IgG secondary antibody. The screening results are shown in Fig. 3.

[0168] The results indicated that, compared to the ELISA reads for wild-type AAV9, 21 of the 122 insertions resulted in over 50%decrease in serum binding. It suggests that these 21 sites have a significant impact on recognition by pre-existing antibodies from the mixed serum. The sites of insertion of the 21 clones and their ELISA signals are listed in table2.

[0169] Table 2. Site of insertion of the 21 clones and their ELISA signals

[0170] The insertion sites are named according to their positions on the amino acid sequence of the VP1 protein. Example 3. Binding Test of Selected AAV9 Mutants Individual to Serum  Samples from Diverse Population

[0171] To further investigate how antibodies from a diverse population recognize the selected AAV mutants, we collected 48 adult peripheral blood serum samples from various countries, including East Asia, Africa, and Eastern Europe. These serum samples are, to some extent, representative of the broad population. We individually tested each of the 48 serum samples for its ELISA binding to the 21 AAV9 variants with insertion at sites listed in Table 1. By comparing these serum samples'recognition of wild-type AAV9 under the same conditions, we assessed the impact of engineered modifications at these sites on pre-existing antibodies recognition in the representative population.

[0172] The results revealed that, in comparisons to the 48 ELISA readings of wild-type AAV9 against the 48 individual serum samples, peptide insertion at 13 positions, including residue 441, 442, 444, 509, 510, 512, 513, 514, 552, 557, 559, 588 and 715 according to the amino acid sequence of VP1 protein, showed significant reduction in their bindings with the majority of the 48 individual serum samples (Fig. 4) . Specifically, among 48 serum dilutions 34 samples had ELISA reads exceeding 0.9 for wild-type AAV binding, with a putative positive rate of 70.8%. Whereas under the same condition, only 3-16 samples reached an ELISA reads of 0.9 for the 13 AAV9 variants, which presented a positive rate ranged between 6.3%-33.3%. In summary, compare with the binding data of wild type AAV9, over 50%of serum samples exhibited significant reduction in their binding to AAV9 variants with insertion at each of the selected 13 positions, including residues 441, 442, 444, 509, 510, 512, 513, 514, 552, 557, 559, 588 and 715 according to the protein sequence of VP1. The locations of the 13 key residuals are labeled in red on AAV9 crystal structures (Fig. 5A) . We also labeled their location in one VP3 subunit for representative (Fig. 5B) .  Example 4. Transduction Inhibition Assay for AAV9 Variants That Escape  Serum Neutralization Antibodies

[0173] The reduction in ELISA signal proved that the AAV mutations can disturb the direct binding with pre-existing anti-AAV antibodies. Anti-AAV antibodies in serum can be neutralizing or non-neutralizing. Neutralizing antibodies not only bind to the AAV capsid but also inhibit vector transduction. In order to test whether the AAV variants we discovered here can escape the neutralizing effect of serum antibodies; transduction inhibition assay was performed to measure the extent of serum antibody inhibiting the AAV-mediated expression of a reporter gene.

[0174] For the transduction inhibition assay, the AAV variant with ST insertion at residue 509 was used as a proof of concept. We generated AAVs containing a reporter gene for easy of detection. Briefly, Nano-Luciferase reporter gene was packed with capsids employed in the previous ELISA screening, including AAV9 wild type (AAV9-wt) and AAV9 mutants with Strep-II tag insertion at 509 (509-ST) . These new AAV constructs with Luciferase reporter gene were produced and purified in a similar way as the AAVs used in the ELISA screening. The serum mixture used in the previous screening (Fig. 3) is serially diluted and pre-incubated with the AAV reporter vectors before inoculating with 293T cells. Following an incubation period of 72 hours to allow for cell transduction, the expression of Nano-Luciferase gene was measured with commercial NanoGlo Luciferase kit. The transduction inhibition effect by serum mixture was assessed by measuring the reduction in expression of Luciferase gene (Fig. 6) .

[0175] As shown in upper panel of Fig. 6, the presence of 1: 810 diluted sera caused over 90%reduction in wild type AAV9 transduction, indicated significant transduction inhibition by the pre-existing neutralization antibodies in the sera samples. However, there is no inhibition detected in the same serum concentration for 509-ST. In fact, even with 1: 10 of serum pre-incubation, the 509-ST variant can still transduce target cells with over 90%efficiency, indicating significant evasion of neutralizing antibodies. The result indicated the AAV variants selected from our previous screening can escape the neutralizing effect of serum antibodies. Example 5. Different Types of Mutations at Key Sites Cause Escaping of  Neutralization Antibodies

[0176] The screening of AAV mutants with StrepII tag insertion allowed us to identify a group of key sites that affect the recognition of serum neutralizing antibodies. It is important to clarify whether the destruction of antibody recognition is due to the specific property of StrepII tag, or different mutations on these key AAV residues will have similar escaping effect. To answer this question, we replaced the octapeptide WSHPQFES of StrepII tag inserted at position 509 with multiple mutation strategies, including insertion of 2 amino acid peptide sequenced PQ (with clone name 509-S2) , 4 amino acid peptide sequenced HPQF (with clone name 509-S4) , and 6 amino acid peptide sequenced SHPQFE (with clone name 509-S6) , as well as completely unrelated sequences including Myc-tag EQKLISEEDL (clone named 509-Myc) , 4-peptide sequence GGGS (clone named 509-GS4) , and 8-peptide sequence GGGSGGGS (clone named 509-GS8) . Additionally, we replaced the original sequences on the AAV9 surface with different peptide of equal length. For site 509, we replaced the DKVMITNE sequence at positions 506-513 of VP1 with the strep-II tag sequence WSHPQFES (clone named 509-RP8) . AAV variants containing Nano-Luciferase reporter gene were generated with these indicated capsids.

[0177] Serum inhibition of gene transduction was tested on different AAV9 variants, and compared to the inhibition on the wild type AAV9 in parallel experiments (Fig. 7) . Consistent with previous experiment that transduction efficiency of wild type AAV9 was significantly inhibited by serum dilutions. However, all insertions with different lengths / sequences at site 509, or replacements around 509 residue, can escape the neutralization effect of serum antibodies. The results showed that it is the site  / position of mutation, rather than the type of mutation, being crucial for disrupting serum antibody recognition.

[0178] We expect that similar property exists with other key residues affecting neutralizing antibody recognition. As a quick test, we replace the strepII tag of clone 559-ST with Myc tag. And generated AAV vectors containing the luciferase reporter gene for these two capsids. Consistent with the result of site 509, the clone 559-Myc just escapes transduction inhibition as efficient as 559-ST does (Fig. 8) . The result further proved that the mutation sites, rather than the mutation types, are critical role for escaping neutralization antibody recognition.

[0179] Because of the high degree of conservation in the capsid amino acid sequences and 3D structures, substantial cross-reactivity of neutralizing antibody has been reported among different AAV serotypes. In order to test if mutations of the corresponding positions on AAV serotypes other than AAV9 will have similar evading effects against serum neutralization antibodies, we generated AAV6 mutants with Strep-II tag-inserted at position 512, 513, 556, 557, or 559 of capsid protein VP1. These selected positions correspond to the same numbered positions on VP1 protein of AAV9, on which mutations showed evading effect against serum neutralization antibodies the previous AAV9 mutant screening. AAV6 and AAV9 have the same length of VP1, and thus the numbering are the same. We tested these 5 mutants of their transduction efficiency in the presence of the mixed human serum that we used in the previous experiment. As shown in Figs. 9-13, compared with wild type AAV6, all these mutants successfully evaded the transduction inhibition effect of serum dilution. These results suggested that the neutralizing antibody evading site we identified on AAV9 may have a similar escape effect on other AAV serotypes.

Claims

1.A modified AAV capsid protein comprising at least one mutated antigenic epitope comprising at least one amino acid mutation at a position selected from the group consisting of 441, 442, 444, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 545, 552, 555, 556, 557, 559, 560, 588 and 715;wherein the numbering corresponds to the wildtype AAV9 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) , and wherein the at least one amino acid mutation substantially reduces binding of serum antibodies to the AAV capsid protein.2.The modified AAV capsid protein of claim 1, wherein the serum antibodies comprise pre-existing anti-AAV antibodies present in serum of a host.3.The modified AAV capsid protein of claim 2, wherein the pre-existing anti-AAV antibodies comprise anti-AAV neutralizing antibodies.4.The modified AAV capsid protein of claim 2 or 3, wherein the host is human.5.The modified AAV capsid protein of any one of the preceding claims, wherein the amino acid mutation is selected from substitution, insertion, deletion, or any combination thereof.6.The modified AAV capsid protein of claim 5, wherein the amino acid mutation comprises an insertion of at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acid residues.7.The modified AAV capsid protein of claim 5 or 6, wherein the insertion is of a length of 2 to 20, 2 to 18, 2 to 16, 2 to 14, 2 to 12, or 2 to 10 amino acid residues.8.The modified AAV capsid protein of any one of the preceding claims, wherein the at least one amino acid mutation comprises one or more mutations at a position selected from the group consisting of positions 509, 510, 512, 513, 514, or any combination thereof.9.The modified AAV capsid protein of any one of the preceding claims, wherein the at least one amino acid mutation comprises one or more mutations at a position selected from the group consisting of positions 559, 557, or any combination thereof.10.The modified AAV capsid protein of any one of the preceding claims, wherein the at least one amino acid mutation comprises one or more mutations at a position selected from the group consisting of positions 509, 510, 512, 513, 514, 559, 557, or any combination thereof.11.The modified AAV capsid protein of any one of the preceding claims, wherein the at least one amino acid mutation comprises a mutation at position 509, a mutation at position 510, and / or a mutation at position 559.12.The modified AAV capsid protein of any one of claims 8 to 11, wherein the one or more mutations comprises at least one amino acid insertion.13.The modified AAV capsid protein of any one of the preceding claims, wherein the AAV capsid protein is of an AAV serotype selected from AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV12, AAV843, AAVbb2, AAVcyS, AAVrh10, AAVrh20, AAVrh39, AAVrh43, AAVrh64, AAVhu37, AAV3B, AAVhu48, AAVhu43, AAVhu44, AAVhu46, AAVhu19, AAVhu20, AAVhu23, AAVhu22, AAVhu24, AAVhu21, AAVhu27, AAVhu28, AAVhu29, AAVhu63, AAVhu64, AAVhu13, AAVhu56, AAVhu57, AAVhu49, AAVhu58, AAVhu34, AAVhu45, AAVhu47, AAVhu51, AAVhu52, AAVhu T41, AAVhu S17, AAVhu T88, AAVhu T71, AAVhu T70, AAVhu T40, AAVhu T32, AAVhu T17, AAVhu LG15, AAVhu9, AAVhu10, AAVhu11, AAVhu53, AAVhu55, AAVhu54, AAVhu7, AAVhu18, AAVhu15, AAVhu16, AAVhu25, AAVhu60, AAVch5, AAVhu3, AAVhu1, AAVhu4, AAVhu2, AAVhu61, AAVrh62, AAVrh48, AAVrh54, AAVrh55, AAVcy2, AAVrh35, AAVrh37, AAVrh36, AAVcy6, AAVcy4, AAVcy3, AAVcy5, AAVrh13, AAVrh38, AAVhu66, AAVhu42, AAVhu67, AAVhu40, AAVhu41, AAVrh40, AAVrh2, AAVbb1, AAVhu17, AAVhu6, AAVrh25, AAVpi2, AAVpi3, AAVrh57, AAVrh50, AAVrh49, AAVhu39, AAVrh58, AAVrh61, AAVrh52, AAVrh53, AAVrh51, AAVhu14, AAVhu31, AAVhu32, AAVrh34, AAVrh33, AAVrh32, Avian AAV ATCC VR-865, Avian AAV strain DA-1 or Bovine AAV.14.The modified AAV capsid protein of any one of preceding claims, wherein the mutated antigenic epitope comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9-68.15.A polynucleotide encoding the AAV modified capsid protein of any of claims 1-14.16.An expression vector comprising the polynucleotide of claim 15.17.A cell comprising the polynucleotide of claim 15 or the expression vector of claim 16.18.An AAV capsid comprising the modified AAV capsid protein of any of claims 1-14.19.An AAV virus vector comprising the AAV capsid of claim 18.20.The virus vector of claim 19, further comprising a nucleic acid comprising at least one terminal repeat sequence, wherein the nucleic acid is encapsidated by the AAV capsid.21.The virus vector of claim 20, wherein the nucleic acid further comprises a cargo nucleic acid operably linked to the at least one terminal repeat sequence.22.The virus vector of claim 20, wherein the cargo nucleic acid encodes a therapeutic protein or RNA.23.A pharmaceutical composition comprising the AAV virus vector of any one of claims 19-22, and a pharmaceutically acceptable carrier.24.A method of delivering a cargo nucleic acid to a cell, comprising contacting the cell with the virus vector of claim 21 or 22.25.A method of delivering a cargo nucleic acid to a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the virus vector of claim 21 or 22 or the pharmaceutical composition of claim 23.26.A method of treating a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the AAV virus vector of claim 21 or 22 or the pharmaceutical composition of claim 23.27.The method of claim 25 or 26, wherein the subject has a serum antibody titer against AAV9 of no more than 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, or 500.28.A method of producing an AAV vector that evades neutralizing antibodies in a host, comprising, a) inserting a short peptide into a variety of sites in VP3 protein to produce a library of modified AAV vectors; b) determining binding of the modified AAV vectors to a sample containing pooled serum of different subjects; c) identifying the modified AAV vector with reduced binding to the serum sample.

Images