Methods for constructing a library of polynucleotides having nucleic acids of interest

Abstract

Disclosed herein is a method for constructing a library of a polynucleotide having a nucleic acid of interest (e.g., a genomic alteration). The method includes (i) mixing the polynucleotide with a primer and an oligonucleotide at a condition that allows the primer and the oligonucleotide, respectively, to anneal to downstream and upstream sequences of the nucleic acid of interest, wherein the primer and the oligonucleotide, respectively, have first and second tags connected to their respective 5'-and 3'-ends; (ii) extending the primer in the presence of a polymerase with the polynucleotide serving as a template, thereby producing an extended sequence annealed to the template; (iii) ligating the extended sequence and the oligonucleotide annealed to the upstream of the nucleic acid of interest to produce a ligated sequence hybridized to the template, in which the ligated sequence has the first and second tags respectively connected to its 5'-and 3'-ends; and (iv) amplifying the product of step (iii) by using first and second tail primers respectively annealed to the first and second tags of the ligated sequence. The library thus constructed is suitable for further analysis to obtain information of the nucleic acid of interest (e.g., genomic alterations).

Description

METHODS FOR CONSTRUCTING A LIBRARY OF POLYNUCLEOTIDES HAVING NUCLEIC ACIDS OF INTERESTREFERENCE TO A SEQUENCE LISTING

[0001] The present application is being filed along with a Sequence Listing in electronic format. The Sequence Listing is provided as a file entitled “P4416_SEQ_AF” , created February 27, 2025, which is 17.3 KB in size. The information in the electronic format of the Sequence Listing is incorporated herein by reference in its entirety. CROSS-REFERENCES TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims priority and the benefit of U.S. Provisional Patent Application No. 63 / 560,875, filed March 04, 2024, the entirety of which is incorporated herein by referenceBACKGROUND OF THE INVENTION

[0003] 1. FIELD OF THE INVENTION

[0004] The present disclosure relates to the field of disease diagnosis. More particularly, the disclosure invention relates to methods for constructing a library of polynucleotides suitable for further analysis (e.g., identifying gene alterations in the polynucleotides) .

[0005] 2. DESCRIPTION OF RELATED ART

[0006] When a normal DNA sequence is changed due to insertions, deletions, point mutations, or gene fusion, it often results in the production of dysfunctional or abnormal proteins, which in turn lead to the occurrence of diseases (e.g., cancers, acute myeloid leukemia (AML) , etc. ) . Accordingly, identifying genetic alteration (s) is crucial for early diagnosis and / or treatment of diseases. The detection of genetic alterations, particularly gene fusions, is hampered by limitations in current methodologies. Gene fusion detection performance is affected by factors such as library preparation technology, exon coverage, and overall detection efficiency. Existing methods for identifying gene fusion are often time-consuming, labor-intensive, and costly.

[0007] Accordingly, there exists in the related art a need for an improved method for correctly and rapidly identifying genetic alterations, such as gene fusion with unknown sequences, with the advantage of a streamlined workflow with fewer steps and reduced processing time.SUMMARY

[0008] In one aspect, the present disclosure is directed to a method for constructing a library of a polynucleotide having a nucleic acid of interest for analysis. The method comprises: (i) mixing the polynucleotide with a primer and an oligonucleotide at a condition  that allows the primer and the oligonucleotide, respectively, to anneal to downstream and upstream sequences of the nucleic acid of interest, wherein the primer and the oligonucleotide, respectively, have first and second tags connected to their respective 5’-and 3’-ends; (ii) extending the primer in the presence ofa polymerase with the polynucleotide  serving as a template thereby producing an extended sequence annealed to the template; (iii) ligating the extended sequence of step (ii) and the oligonucleotide annealed  to the upstream of the nucleic acid of interest to produce a ligated sequence hybridized to the template, in which the ligated sequence has the first and second tags, respectively, connected to its 5’-and 3’-ends; and (iv) amplifying the product of step (iii) by using first and second tail primers,  respectively, annealed to the first and second tags of the ligated sequence

[0009] According to optional embodiments of the present disclosure, the method further comprises (iii-1) purifying the ligation product prior to step (iv) .

[0010] According to embodiments of the present disclosure, the polynucleotide is RNA or DNA. In some embodiments, the polynucleotide is the RNA, and in step (ii) , the extended sequence is a complementary DNA (eDNA) . In other embodiments, the polynucleotide is the DNA.

[0011] According to embodiments of the present disclosure, the primer comprises a sequence that forms a hairpin loop structure therein.

[0012] According to embodiments of the present disclosure, the primer is about 5 to 12 nucleotides in length provided that the primer has a random sequence.

[0013] According to embodiments of the present disclosure, the nucleic acid of interest comprises a genomic alteration. Exemplary genomic alterations that may be detected by the present method include, but are not limited to, a point mutation, a deletion, an insertion, a duplication, an inversion, a fusion, or a combination thereof.

[0014] According to embodiments of the present disclosure, each of the first and second tags independently comprises a sequence that is any one of a priming sequence, a barcode, an index, or a combination thereof.

[0015] According to embodiments of the present disclosure, the polynucleotide is derived from a biological sample that is any one of blood, serum, oral mucosa, body fluids, hair roots, tissues, feces, bodily secretions, medium, or plant.

[0016] Many of the attendant features and advantages of the present disclosure will become better understood with reference to the following detailed description considered in connection with the accompanying drawings.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0017] The present description will be better understood from the following detailed description read in light of the accompanying drawings, where:

[0018] FIG. 1 is a diagram depicting steps of the present method 100 in accordance with one embodiment of the present disclosure;

[0019] FIG. 2 depicts the purified eDNA product peak in accordance with Example 1 of the present disclosure;

[0020] FIG. 3 depicts the amplification of ALK and FGFR3 genes in accordance with Example 2 of the present disclosure;

[0021] FIG. 4 depicts the identification of ALK and FGFR3 genes in accordance with Example 2 of the present disclosure;

[0022] FIG. 5 depicts the amplification of genes using primers with varied length in accordance with Example 3 of the present disclosure; and

[0023] FIG. 6 depicts the identification of genes using primers with varied length in accordance with Example 3 of the present disclosure.DESCRIPTION

[0024] The detailed description provided below in connection with the appended drawings is intended as a description of the present examples and is not intended to represent the only forms in which the present example may be constructed or utilized. The description sets forth the functions of the example and the sequence of steps for constructing and operating the example. However, the same or equivalent functions and sequences may be accomplished by different examples.

[0025] 1. Definitions

[0026] For convenience, certain terms employed in the specification, examples and appended claims are collected here. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of the ordinary skills in the art to which this invention belongs.

[0027] As used herein, the term “polynucleotide” and “nucleic acid” are used interchangeably herein to describe a polymer composed of nucleotides (i.e., deoxyribonucleotides or ribonucleotides) of any length, such as greater than 10 nucleotides, greater than 50 nucleotides, greater than 100 nucleotides, greater than 500 nucleotides, greater than 1,000 nucleotides, or greater than 5,000 nucleotides. Naturally occurring nucleotides include guanine (G) , cytosine (C) , adenine (A) , and thymine (T) . According to embodiments of the present disclosure, the polynucleotide may be mammalian, viral, fungal, or bacterial, or a mixture thereof. In some embodiments, the polynucleotide is a genomic DNA or a fragment thereof.

[0028] As used herein, the term “nucleic acid of interest” refers to a nucleic acid to be analyzed, in some embodiments, the “nucleic acid of interest” comprises both a known or pre-determined sequence and adjacent nucleotides to be analyzed, which may be referred to as “an unknown sequence. ” According to embodiments of the present disclosure, the “nucleic acid of interest” may have a length of 10 or more nucleotides, 20 or more nucleotides, 30 or more nucleotides, 40 or more nucleotides, 50 or more nucleotides, 60 or more nucleotides, 70 or more nucleotides, 80 or more nucleotides, 90 or more nucleotides, 100 or more nucleotides, 200 or more nucleotides, 300 or more nucleotides, 400 or more nucleotides, 500 or more nucleotides, or 1,000 or more nucleotides. In some embodiments, the “nucleic acid of interest” has a length of 10 to 100 nucleotides, 10 to 200 nucleotides, 10 to 300 nucleotides, 10 to 400 nucleotides, 10 to 500 nucleotides, 10 to 1,000 nucleotides, 50 to 100 nucleotides, 50 to 200 nucleotides, 50 to 300 nucleotides, 50 to 400 nucleotides, 50 to 500 nucleotides, or 50 to 1,000 nucleotides.

[0029] The term “hybridization” , “hybridizing” or “hybridize (s) to” refers to a process where completely or partially complementary nucleic acid strands are joined by hydrogen bonds to form a double-stranded structure or region under specified conditions. Note that hydrogen bonds typically form between adenine (A) and thymine (T) or uracil (U) nucleotides, or between cytosine (C) and guanine (G) nucleotides.

[0030] The term “anneal” refers to the formation of one or more complementary base pairs between two nucleic acids. In some embodiments, annealing involves two completely or substantially complementary nucleic acid strands hybridizing together. In some embodiments, in the context of an extension reaction, annealing involves the hybridization of primer to a template such that a primer extension substrate for a template-dependent polymerase enzyme is formed. The condition for annealing may vary based on the length and sequence of the primer. In some embodiments, conditions for annealing are based on a calculated Tm of a primer. In some embodiments, an annealing step of an extension reaction involves reducing the temperature after strand separation step to a temperature based on the calculated Tm for a primer, for a time sufficient to permit such annealing. In some embodiments, the calculated Tm can be determined by any known software, such as VENTRO NTITM (Invitrogen, Inc. California) , Primer3 (Premier Biosoft, Palo Alto, Califomia) and the like. For most amplifications, the annealing temperature may be selected to be 5℃ below the predicted Tm, though temperatures closer to or above the predicted Tm can be used as well. According to embodiments of the present disclosure, the time used for primer annealing during an extension reaction is determined based on primer and template concentrations. In some embodiments, the time for primer annealing step in an extension reaction may be in the range of 1 second to 15 minutes, such as 10 seconds to 10 minutes, 30 seconds to 5 minutes, or 60 seconds to 2 minutes.

[0031] The term “primer” means an oligonucleotide capable of acting as a point of initiation of nucleic acid synthesis upon forming a duplex with a polynucleotide template and being extended from its 3’-end along the template so that an extended duplex is formed. The sequence of nucleotides being added during the extension process is determined by the sequence of the template polynucleotide. A primer serves as a point of initiation of nucleic acid synthesis catalyzed by DNA polymerase, RNA polymerase or reverse transcriptase. According to some preferred embodiments of the present disclosure, a primer (e.g., the primer having a sequence specific to the target or a random sequence) serves as an initiation point for nucleic acid synthesis catalyzed by reverse transcriptase. According to other preferred embodiments of the present disclosure, a primer (e.g., a tail primer) serves as an initiation point for nucleic acid synthesis catalyzed by DNA polymerase.

[0032] The term “tag” as used herein refers to a nucleic acid sequence attached to a polynucleotide of interest (e.g., a nucleic acid of interest, a polynucleotide comprising the nucleic acid of interest, a primer and etc. ) . A tag can be single stranded or double-stranded, and may be DNA, RNA or artificial nucleotides. A tag may be located at one end of the polynucleotide of interest (e.g., at the 5’-or 3’-end of a primer sequence) , or it can be in a middle or interior portion of the polynucleotide of interest. The tag can add one or more functionalities or properties to the polynucleotide of interest, such as providing a priming site for amplification or sequencing, adding a barcode or an index for identification, or adding a sequence for connecting to another polynucleotide (e.g., an adaptor) . By way of example, the tag can be a universal primer and / or a universal priming site. By way of a further example, the tag can contain one or more barcodes of various types or for various purposes, such as molecular barcodes, sampling barcodes, target-specific barcodes, or platform-specific sequences for recognition by the sequencer. Various tags are known in the relevant field and can be used in the present disclosure. Tags may include separate sequences respectively attached to 5’-and 3’-ends of the polynucleotide of interest. A tag can also include a stem-loop structure therein, in which a hairpin loop is attached to an end of the polynucleotide, while the stem portion can be cleaved before amplification or sequencing. A tag can be attached to the polynucleotide of interest by any suitable means, including, but not limited to, ligation, use of a transposase, hybridization and / or primer extension. For example, a tag (e.g., an adapter, a barcode and etc. ) may be ligated to ends of the polynucleotide of interest. According to some embodiments of the present disclosure, a tag that comprises a target-specific barcode is attached to the 5’-end of a target-specific primer, which allows synthesis of a complementary strand of the target sequence thereby allowing the tag being attached to the 5’-end of the complementary strand of the target sequence after primer extension.

[0033] The term “genomic alteration (s) ” as used herein refers to a point mutation, a deletion, an insertion, an inversion, a duplication, a fusion or a combination thereof found in one or more genes. The term “fusion” when applied to a gene refers to gene alteration including a hybrid gene formed from two previously independent genes or portions thereof or a particular gene formed from at least two independent exons thereof.

[0034] The term “biological sample” as used herein refers to blood, serum, oral mucosa, body fluids, hair roots, tissues, feces, bodily secretions, medium, or plant.

[0035] Ranges of values are disclosed herein. The ranges set out a lower limit value and an upper limit value. Unless otherwise stated, the ranges include all values to the magnitude of the smallest values (either lower limit value or upper limit value) and ranges between the values of the stated ranges.

[0036] The singular forms “a” , “an” , and “the” are used herein to include plural referents unless the context clearly dictates otherwise.

[0037] 2. Methods for constructing a library of a polynucleotide intended to be analyzed

[0038] The method described herein is to construct a library ofa polynucleotide intended to be analyzed, particularly the polynucleotide that contains genetic alterations such as point mutations, deletions, insertions, duplications, inversions, fusions etc., so that sequence information leading to the genetic alterations may be obtained after analyzing the library.

[0039] Reference is made to Fig. 1, which illustrates steps of constructing a library of a polynucleotide comprising a nucleic acid of interest (i.e., one or more genomic alterations) . The present method 100 commences by mixing the polynucleotide 110 derived from a biological sample (e.g., blood, serum, saliva, mucus etc. ) with a primer 116 and an oligonucleotide 118 in a condition that allows the oligonucleotide 118 and the primer 116, respectively, to anneal to upstream and downstream sequences 112, 114 of the nucleic acid of interest 111. According to embodiments of the present disclosure, the primer 116 and the oligonucleotide 118 may independently comprise sequences that are fully or partially complementary to downstream and upstream sequences 114, 112 of the nucleic acid of interest 111, thereby allowing the primer 116 and the oligonucleotide 118 to be annealed thereto. In some embodiments, the primer 116 comprises a sequence specific to the downstream sequence 114 of the nucleic acid of interest 111, while the oligonucleotide 118 comprises a random sequence. In other embodiments, the primer 116 comprises a random sequence (e.g., six As, six Ts and the like) , while the oligonucleotide 118 comprises a sequence specific to the upstream sequence 112 of the nucleic acid of interest 111. According to further embodiments of the present disclosure, in the case when the primer has a random sequence (e.g., six As, six Ts etc. ) , it is preferably about 5 to 12 nucleotides in length, such as 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 nucleotides in length. In some embodiments, the primer is a hexamer and comprises six random nucleotides (e.g., six As, six Ts and the like) . At least one tag may be attached to the oligonucleotide 118 and / or the primer 116. As depicted, the primer 116 further includes a first tag 117 connected to its 5’-end, while the oligonucleotide 118 further includes a second tag 119 connected to its 3’-end. The first and second tags 117, 119 may independently comprise a priming sequence for initiating a sequence extension reaction. Alternatively, the first and second tags 117, 119 may independently comprise a molecular barcode (e.g., unique molecular identifier, UMI) or an index suitable for identifying the presence of the molecule or its origin. The terms “barcode, ” “molecular barcode, ” and “index” are used interchangeably and generally referring to a nucleotide sequence of a nucleic acid that is useful as an identifier, such as a source identifier, a location identifier or other identifier of the nucleic acid. In some embodiments, barcode or index sequences may provide a source or location identifier for a target nucleic acid. Optionally or in addition, the first and second tags 117, 119 may independently comprise an adapter sequence suitable for coupling with another adapter sequence in another polynucleotide.

[0040] As depicted in Fig. 1, although the primer 116 and the oligonucleotide 118 respectively anneal to the downstream and upstream sequences 114, 112 of the nucleic acid of interest 111, however, only the primer 116 can be extended, as polymerization of nucleotides always proceeds from the 5’-end of the primer. Accordingly, the primer 116 is extended from its 3’-end via use of a polymerase with the polynucleotide 110 serving as a template, thereby producing an extended sequence 120 annealed to the polynucleotide template 110. In the case when the polynucleotide 110 is RNA, the primer 116 may be extended in the presence of a reverse transcriptase to produce an extended complementary deoxynucleic acid (cDNA) sequence 120 annealed to the RNA template 110. In the case when the polynucleotide 110 is DNA, the primer 116 may be extended by DNA polymerase (e.g., Taq polymerases) to produce an extended DNA sequence 120 annealed to the DNA template 110. According to certain embodiments of the present disclosure, the extension is performed under the following conditions: denature at 65℃ for 5 minutes, following by melting at 98℃ for 1 minute, annealing at 37℃ for 10 minutes, and extension at 60℃ for 10 minutes. Other reaction conditions may be used. For example, the annealing / extension temperature may be adjusted to account for the differences in the salt concentration in the reaction buffer, which may comprise one or more salts (e.g., KCl, MgCl2) , at least one buffering agent (e.g., Tris-HCl) and a carrier (e.g., bovine serum albumin (BSA) , dithiothreitol (DTT) ) ; or slowing the ramp rate (e.g., l℃ / s, 0.5℃ / sor slower) , for example, from 98℃ to 37℃, may improve the primer performance. A non-limiting example of the reaction buffer for extension reaction comprises 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃) , and 10 mM DTT.

[0041] The extension product of the primer 116 is then joined with the oligonucleotide 118 by DNA ligation. Specifically, the 3’-end of the extended sequence 120 is connected to the 5’-end of the oligonucleotide 118 with the aid of a DNA ligation enzyme (i.e., ligase) thereby forming a ligated sequence 121 comprising in its structure, from 5’-end to 3’-end, the first tag 117, the primer 116, the extended sequence 120, the oligonucleotide 118, and the second tag 119, which hybridizes with the polynueleotide template 110 and forms a duplex 122. According to embodiments of the present disclosure, the ligation is performed under the following conditions: ligation at 25℃ for 60 minutes, followed by incubation at 65℃ for 60 minutes in a reaction buffer, which comprises 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25℃) , and 10 mM DTT.

[0042] Optionally, or in addition, the template strand 110 is degraded from the duplex 122 with the aid of a nuclease (e.g., RNase H or DNase) , thereby leaving behind the ligated strand 121 undegraded. Still optionally or in addition, the duplex 122 or the ligated strand 121 per se is purified or isolated from the unreacted reactants or reagents (e.g., primers, salts, enzymes, buffers etc. ) before being subject to subsequent amplification reactions. Any suitable isolation method may be used to separate the extension products from enzymes, primers, and / or other components. In some embodiments, the isolation may comprise Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) cleanup. Methods for SPRI cleanup are well known in the related art and kits are commercially available. In some embodiments, enzymes for extension / ligation step can be inactivated by heat treatment. As to unhybridized primers, they can be removed by appropriate methods, such as purification, digestion, etc. In some embodiments, a nuclease is used to remove primers from the preparation. In some embodiments, such nucleases are heat inactivated after primer digestion.

[0043] The duplex 122 or optionally, the ligated strand 121, is then amplified with two tail primers 123, 124 via polymerase chain reaction (PCR) to produce amplicons, which independently comprise the present polynucleotide 110. As depicted in Fig 1, the tail primer 124 comprises a sequence complementary to the second tag 119, thus may hybridize and anneal to the second tag 119 and provide its 3’-end as a substrate for template-dependent polymerase (e.g., Taq polymerases) to catalyze the polymerization of nucleotides and produce extension products, which are complementary to the template (i.e., the duplex 122 or the ligated strand 121) . The newly produced sequence 130, which is complementary to the sequence of the ligated strand 121, comprises from 5’-end to 3’-end, the tail primer 124, an extended sequence 125 having an end sequence 117a that is complementary to that of the first tag 117. The newly produced sequence 130 then serves as the template for the synthesis of its complementary strand by use of another tail primer 123, which hybridizes and anneals to the end sequence 117a to catalyze the polymerization of nucleotides and produce an extension product. According to embodiments of the present disclosure, the two tail primers 123, 124 are designed such that they will specifically anneal to their complementary sequences in first and second tags 117, 119 at an annealing temperature from about 55 to 70℃. The amplification is performed under the following conditions: initial denaturation at 98℃ for 30 seconds, followed by 5-30 cycles comprising melting at 98℃ for 15 seconds, annealing at 60℃for 10 seconds, and extension at 72℃ for 30 seconds; and final extension at 72℃ for 5 minutes. Other reaction conditions may be used.

[0044] The library thus constructed may then be used for further analysis, such as sequence analysis to resolve the one or more gene alterations present in the nucleic acid of interest. According to optional embodiments of the present disclosure, the library or the amplified products thus generated are purified and sequenced to obtain sequence information of the nucleic acid of interest (e.g., gene alterations) in the polynucleotide. Any suitable isolation method described above may be used to separate the amplified nucleic acids from enzymes, primers, and / or other components. In some embodiments, sequencing may be performed by next-generation sequencing or massive parallel sequencing method. As used herein, “next-generation sequencing (NGS) ” refers to oligonucleotide sequencing technologies that have the capacity to sequence oligonucleotides at speeds above those possible with conventional sequencing methods (e.g., Sanger sequencing) , due to performing and reading out thousands to millions of sequencing reactions in parallel. Non-limiting examples of next-generation sequencing methods / platforms include Massively Parallel Signature Sequencing (Lynx Therapeutics) , 454 pyrosequencing (454 Life Sciences / Roche Diagnostics) , Solid-phase, reversible dye-terminator sequencing (Solexa / Illumina) , Ion semiconductor sequencing (ION Torrent) , and the like.

[0045] According to some embodiments of the present disclosure, a novel gene fusion occurring downstream to a known target gene is detected after sequencing. According to other embodiments of the present disclosure, novel gene skipping that has occurred upstream of a known target gene region is detected after sequencing.

[0046] Examples

[0047] Example 1: Targeted RNA sequencing for detecting genetic alterations

[0048] In this example, a known ribonucleic acid was used as the target sequence to demonstrate the feasibility of the present method. Specifically, 50 ng of universal human reference RNA (Agilent, catalog number 740000) was denatured at 65℃ for 5 minutes in a reaction mixture (10 μl) , which contained 100 nM of an adapter-conjugated target-specific primer (SEQ ID NO: 2) , 100 nM of an adapter-conjugated oligonucleotide (SEQ ID NO: 1) , and 0.5 mM dNTPs. The reaction was immediately chilled on ice for 3 minutes. Note that the adapter was a barcode of UMI.

[0049] Table 1. The polynucleotide sequences of primer and oligonucleotide

[0050] Subsequently, reverse transcription buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.3 at 25℃, 75 mM KC1, 3 mM MgCl2, and 10 mM DTT) , RNase inhibitor, and a reverse transcriptase enzyme were added to the reaction mixture to achieve a final reaction volume of 20 μl. The reaction was incubated at 98℃ for 1 minute, 37℃ for 10 minutes, and 60℃ for 10 minutes.

[0051] Following reverse transcription, ligation reaction buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5 at 25℃, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT) and 500 nM ligase were added to the reaction mixture. Ligation was performed at 25℃ for 60 minutes, followed by an incubation at 65℃ for 60 minutes.

[0052] Then, 40 μl of the ligation reaction mixture was combined with 10 μl of 10X RNase H Reaction Buffer, and 1μl ofRNase H (5 units) . Nuclease-free water was added to bring the final volume to 100 μl. The resulting reaction mixture was incubated at 37℃ for 20 minutes to allow RNA degradation by RNase H, and then at 65℃ for 20 minutes.

[0053] The thus obtained product was subjected to amplification using a universal primer to generate a library of amplicons, which were purified by use of AMPure XP beads. An amplified cDNA product peak is clearly seen in FIG. 2, which confirmed the feasibility of the present method in synthesizing and amplifying the target gene sequence.

[0054] Example 2: Identifying novel gene fusions

[0055] In this example, primers and oligonucleotides as listed in Table 2 were designed and used to identify fusion genes including fusions to FGFR1, FGFR2, FGFR3, NTRK1, NTRK2, NTRK3, RET, and ALK from the 5′ end or the 3′ end of a target fusion gene. The amplification was performed in accordance with similar procedures described in Example 1.

[0056] The identification results for ALK and FGFR3 genes are illustrated in FIGs. 3 and 4. It is expected that FGFR1, FGFR2, NTRK1, NTRK2, NTRK3, and RET could be successfully identified by using the primer / oligonucleotide sets listed in Table 2.

[0057] Table 2. The polynucleotide sequences of primers and oligonucleotides Note: Nueleotide symbol “N” stands for Adenine / Guanine / Cytosine / Thymine.

[0058] Example 3: Effect of the length of the random primer on PCR Efficiency

[0059] Random primers are designed to bind randomly within the target region. In this example, whether the length of a random primer sequence may affect the performance of PCR is investigated. To this purpose, random primers of varied length (i.e., 5-, 6-, 8-or 12-mcr) with an ALK exon 22 oligonucleotide were designed and used in this embodiment for the identification ofALK genomic alterations between exon 19 and 22. Results are illustrated in FIGs. 5 and 6.

[0060] FIG. 5 is a line graph depicting the relative fluorescence intensity of the PCR products generated using random primers of varied length, The data in FIG. 6 demonstrates that each primer, independently having 5 to 12 nucleotides in length, could successfully generate eDNA products suitable for subsequent PCR amplification.

[0061] Example 4: Identifying skipping mutation in MET gene

[0062] In this example, primers were designed and synthesized to identify skipping mutations in a MET exon. To this purpose, the oligonucleotide and the primer targeting the MET gene as listed in Table 3 were designed and used in this embodiment, and skipping mutations were successfully identified.

[0063] Table 3. The polynucleotide sequences of primers

[0064] Example 5: Identifying gene mutations associated with acute myeloid leukemia (AML)

[0065] To detect mutations associated with AML, primer and oligonucleotide targeting the FLT3 gene as listed in Table 4 were designed to identify internal tandem duplications (lTD) and tyrosine kinase domain (TKD) mutations (i.e., D835 and I836) based on the known nucleotide sequence of the FLT3 gene. As a result, FLT3 mutations were successfully identified.

[0066] Table 4. The polynucleotide sequences of primer and oligonucleotide

[0067] In sum, results from the examples confirmed that the present method and primers could successfully identify gene alterations (e.g., mutations, fusions, deletions and etc. ) , thus are useful for prognosis and diagnosis of a disease, such that the patient having the disease may be identified and treated.

[0068] It will be understood that the above description of embodiments is given by way of example only and that various modifications may be made by those with ordinary skill in the art. The above specification, examples, and data provide a complete description of the structure and use of exemplary embodiments of the invention. Although various embodiments of the invention have been described above with a certain degree of particularity, or with reference to one or more individual embodiments, those with ordinary skill in the art could make numerous alterations to the disclosed embodiments without departing from the spirit or scope of this invention.

Claims

1.A method for constructing a library of a polynucleotide having a nucleic acid of interest for analysis comprising:(i) mixing the polynucleotide with a primer and an oligonucleotide at a condition that allows the primer and the oligonucleotide respectively to anneal to downstream and upstream sequences of the nucleic acid of interest, wherein the primer and the oligonucleotide, respectively, have first and second tags connected to their respective 5’-and 3’-ends;(ii) extending the primer in the presence of a polymerase with the polynucleotide serving as a template, thereby producing an extended sequence annealed to the template;(iii) ligating the extended sequence of step (ii) and the oligonucleotide annealed to the upstream of the nucleic acid of interest to produce a ligated sequence hybridized to the template, in which the ligated sequence has the first and second tags, respectively, connected to its 5’-and 3’-ends; and(iv) amplifying the product of step (iii) by using first and second tail primers respectively annealed to the first and second tags of the ligated sequence.2.The method of claim 1, further comprising:(iii-1) purifying the ligation product prior to step (iv) .3.The method of claim 1, wherein the polynucleotide is RNA or DNA.4.The method of claim 3, wherein the polynucleotide is the RNA, and in step (ii) , the extended sequence is a complementary DNA (cDNA) .5.The method of claim 1, wherein the primer comprises a sequence that forms a hairpin loop structure therein.6.The method of claim 1, wherein the primer is about 5 to 12 nucleotides in length provided that the primer has a random sequence.7.The method of claim 1, wherein the nucleic acid of interest comprises a genomic alteration.8.The method of claim 7, wherein the genomic alteration is a point mutation, a deletion, an insertion, a duplication, an inversion, a fusion, or a combination thereof.9.The method of claim 1, wherein the first and second tags independently comprises a sequence that is any one of a priming sequence, an adapter, a barcode, an index, or a combination thereof.10.The method of claim 1, wherein the polynucleotide is derived from a biological sample selected from the group consisting of blood, serum, oral mucosa, body fluids, hair roots, tissues, feces, bodily secretions, medium, and plant.

Images