Ionizable lipid derived from alkyl substituted 1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane, compositions and uses thereof

Abstract

Disclosed is an ionizable lipid comprising alkyl substituted 1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane. Also disclosed is a lipid nanoparticle for delivering a nucleic acid, comprising the ionizable lipid as disclosed herein. Also disclosed is a nucleic acid-lipid nanoparticle comprising a nucleic acid and the lipid nanoparticle as disclosed herein. Further disclosed are pharmaceutical compositions and immunogenic compositions of the nanoparticles. Further disclosed are a method of treating a subject having a disease caused by deficiency in a functional peptide or protein and a method for vaccinating a subject, comprising administering to the subject the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein.

Description

IONIZABLE LIPID DERIVED FROM ALKYL SUBSTITUTED 1, 4, 7-TRIAZACYCLONONANE OR 1, 4, 7, 10-TETRAAZACYCLODODECANE, COMPOSITIONS AND USES THEREOFFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present invention generally relates to an ionizable lipid for delivering nucleic acid. The present invention also relates to the use of the ionizable lipid to treat a disease or vaccinate a subject.BACKGROUND

[0002] Oligonucleotides, such as DNA, messenger RNA (mRNA) , antisense oligonucleotides (ASOs) , micro RNAs (miRNAs) , CpG oligodeoxynucleotide (ODNs) , and small interfering RNAs (siRNAs) , have shown considerable promise for therapeutic applications. Among these, mRNA is becoming an increasingly important approach for the prevention or treatment of a variety of diseases. Administration of mRNA to a patient in need can increase the expression of protein encoded by the mRNA within the patient′s body. mRNA therapy has several advantages. First, mRNA is only transiently expressed, it may be safer than conventional virus vector mediated delivery of DNA, especially in pediatric indications. In addition, compared to DNA, it is not necessary for mRNA to enter the nucleus to be translated. However, nucleic acid therapeutics including mRNA, have relatively high molecular weights and charge densities, making them impermeable to the cellular membrane. In vitro biological activities of these nucleic acids require the aid of transfection agents, such as OligofectamineTM from Invitrogen, in order to be effective. Delivery vehicles made from cationic lipid or polymer delivery vehicles are commonly used to encapsulate mRNA for efficient in vivo delivery of mRNA, which may help protect the mRNA from endogenous RNases. Yet, delivery of mRNA to cells in vivo to allow therapeutic levels of protein expression is still a challenge, particularly for mRNA encoding full length proteins. The low level of translation has greatly hindered the exploitation of mRNA therapy when a high level of expression of the mRNA encoded protein is needed to reach therapeutic threshold.

[0003] In addition, mRNA has also been used as vaccines, but the therapeutic efficacy of such vaccines has been inconsistent.

[0004] Thus, there remains a strong need in the art for novel and more efficient methods and compositions for introducing nucleic acids such as mRNA into cells, for therapeutic applications and / or as vaccines. The present invention addresses these and other needs. The present invention provides novel ionizable lipids and lipid nanoparticles comprising the novel ionizable lipids which outperform the current commercial lipid nanoparticle formulations in mRNA delivery and protein expression.SUMMARY

[0005] In one aspect, the present disclosure refers to an ionizable lipid comprising alkyl substituted 1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane, the ionizable lipid having the structure of Formula I:

[0006] wherein:

[0007] X is selected from the group consisting of:

[0008] M, W, U and V are each independently selected from the group consisting of:

[0009] D and Q are each selected from the group consisting of:

[0010] n1, n2, n3, n4, n5 and n6 are integers between 1 and 20; and

[0011] X is N, O or S.

[0012] In another aspect, the present disclosure refers to a lipid nanoparticle for delivering a nucleic acid, comprising the ionizable lipid as disclosed herein.

[0013] In another aspect, the present disclosure refers to a nucleic acid-lipid nanoparticle comprising: (a) a nucleic acid; and (b) the lipid nanoparticle as disclosed herein.

[0014] In another aspect, the present disclosure refers to a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0015] In another aspect, the present disclosure refers to an immunogenic composition comprising the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and / or adjuvant.

[0016] In another aspect, the present disclosure refers to an in vitro method for introducing a nucleic acid into a cell, the method comprising contacting the cell with the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein.

[0017] In another aspect, the present disclosure refers to a method for the in vivo delivery of a nucleic acid, the method comprising administering to a subject a nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein.

[0018] In another aspect, the present disclosure refers to a method of treating a subject having a disease caused by deficiency in a functional peptide or protein, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein or the pharmaceutical composition as disclosed herein, wherein the nucleic acid is a mRNA encoding the functional peptide or protein, wherein following administration the functional peptide or protein is expressed in a target cell.

[0019] In another aspect, the present disclosure refers to use of the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein or the pharmaceutical composition as disclosed herein in the manufacture of a medicament for treating a subject having a disease caused by deficiency in a functional peptide or protein, wherein the nucleic acid is a mRNA encoding the functional peptide or protein, wherein following administration the functional peptide or protein is expressed in a target cell.

[0020] In another aspect, the present disclosure refers to a method for vaccinating a subject to prevent or treat a disease selected from the group consisting of an infection and a cancer, the method comprising administering to the subject the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein or the immunogenic composition as disclosed herein,  wherein the nucleic acid is an mRNA encoding an antigen (or a fragment thereof) associated with the disease, and upon administration, the antigen is expressed to elicit an immune response against the disease.

[0021] In another aspect, the present disclosure refers to use of the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein or the immunogenic composition as disclosed herein in the manufacture of a medicament for vaccinating a subject to prevent or treat a disease selected from the group consisting of an infection and a cancer, wherein the medicament is to be administered to the subject, wherein the nucleic acid is an mRNA encoding an antigen (or a fragment thereof) associated with the disease, and upon administration, the antigen is expressed to elicit an immune response against the disease.

[0022] Advantageously, the present disclosure relates to a novel ionizable lipid consisting of a central 1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane. Compared to current commercial lipid nanoparticle formulation, it achieves enhanced nucleic acid (such as mRNA) delivery and protein production, as well as targeted nucleic acid delivery to the lung and the spleen after administration to a subject.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0023] The invention will be better understood with reference to the detailed description when considered in conjunction with the non-limiting examples and the accompanying drawings, in which:

[0024] Figure 1 is a schematic drawing illustrating the developed ionizable lipids which consist of a central 1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane head (A-H) and alkyl tails (1-17) .

[0025] Figure 2 shows heatmaps of HEK 293T cells, pulmonary epithelial cell line (A549) and murine dendric cell line (DC2.4) treated with Renilla Luciferase mRNA loaded lipid nanoparticles (Luc-LNP) . The relative luciferase expression ratio of Luc-LNP with and without the involvement of the developed ionizable lipids after incubation with Luc-LNPs overnight is shown on the heat map.

[0026] Figure 3 shows that Balb / c mice were treated with Luc-loaded LNPs intramuscularly. The relative luciferase expression of Balb / c mice is shown after 6 h administration of Luc-LNP intramuscularly.

[0027] Figure 4 shows the results of Balb / c mice treated with nucleoprotein (NP) encoded mRNA-loaded LNPs via intramuscular administration. Mice were vaccinated with  NP mRNA-LNP on day 0 and day 14. Cellular immune response and antibody expression were determined by flow cytometry and Enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay.

[0028] Figure 5 shows representative whole-body and major organs bioluminescence images of mice of E-series LNPs showing delivery tendency to spleen. Mice were injected with Fluc mRNA-loaded E-series LNPs at a single dose of 0.5 mg / kg. Images were taken at 6 h postinjection (n = 3) .

[0029] Figure 6 shows representative whole-body and major organs bioluminescence images of mice of F-series LNPs measured by the IVIS imaging system showing delivery tendency to lung. Mice were injected with Fluc mRNA-loaded F-series LNPs at a single dose of 0.5 mg / kg. Images were taken at 6 h postinjection (n = 3) .

[0030] Figure 7 shows the synthesis schemes of the lipids of the present invention. A. Synthesis scheme of lipid A1; B. Synthesis scheme of lipid A8; C. Synthesis scheme of lipid A16; D. Synthesis scheme of lipid B1; E. Synthesis scheme of lipid B8; F. Synthesis scheme of lipid B16; G. Synthesis scheme of lipid D1; H. Synthesis scheme of lipid D8; I. Synthesis scheme of lipid D16; J. Synthesis scheme of lipid E1; K. Synthesis scheme of lipid E8; L. Synthesis scheme of lipid E16.DETAILED DESCRIPTION

[0031] The present invention relates to a compound of ionizable lipid consisting of a central 1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane with substituted alkyl chains, or a composition comprising the ionizable lipid consisting of a central 1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane with substituted alkyl chains for the treatment or prevention of a disease in a subject in need thereof. The compositions have been found to effectively deliver messenger RNA (mRNA) to a subject or cell, and to induce higher protein production as compared with current commercial lipid nanoparticle formulation.

[0032] In one aspect, the present disclosure refers to ionizable lipid comprising alkyl substituted 1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane, the ionizable lipid having the structure of Formula I:

[0033] wherein:

[0034] X is selected from the group consisting of:

[0035] M, W, U and V are each independently selected from the group consisting of:

[0036] D and Q are each selected from the group consisting of:

[0037] n1, n2, n3, n4, n5 and n6 are integers between 1 and 20; and

[0038] X is N, O or S.

[0039] For the compound shown as Formula I, it has a head or central group which is either1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane, which can be substituted with alkyl chains.

[0040] In one example, the head group of the ionizable lipid having the structure of Formula I has a structure A:  In another example, the head group of the ionizable lipid having the structure of Formula I has a structure B:  In another example, the head group of the ionizable lipid having the structure of Formula I has a structure C:  In another example, the head group of the ionizable lipid having the structure  of Formula I has a structure D:  In another example, the head group of the ionizable lipid having the structure of Formula I has a structure E:  In another example, the head group of the ionizable lipid having the structure of Formula I has a structure F:  In another example, the head group of the ionizable lipid having the structure of Formula I has a structure G:  In another example, the head group of the ionizable lipid having the structure of Formula I has a structure H:

[0041] Each of the head groups disclosed herein can be substituted by alkyl chains. In one example, the alkyl chain has a structure 1:  In another example, the alkyl chain has a structure 2:  In another example, the alkyl chain has a structure 3:  In another example, the alkyl chain has a structure 4:  In another example, the alkyl chain has a structure 5:  In another example, the alkyl chain has a structure 6:  In another example, the alkyl chain has a structure 7:  In another example, the alkyl chain has a structure 8:  In another example, the alkyl chain has a structure 9:  In another example, the alkyl chain has a structure 10:  In another example, the alkyl chain has a structure 11:  In another example, the alkyl chain has a structure 12:  In another example, the alkyl chain has a structure 13:  In another example, the alkyl chain has a  structure 14:  In another example, the alkyl chain has a structure 15: In another example, the alkyl chain has a structure 16:  In another example, the alkyl chain has a structure 17:

[0042] For the compound shown as Formula I, its head or central group which is either1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane, can be substituted with one or more of the same alkyl chain as disclosed herein, or substituted with one or more different alkyl chains disclosed herein.

[0043] n one particular example, the ionizable lipid as disclosed herein has a headgroup H as disclosed herein, which is substituted by alkyl chain having a structure 17 as disclosed herein, and has a structure of Formula II (and is named H17) :

[0044] The lipid having the structure of Formula I as disclosed herein are ionizable lipids, composed of an amine moiety and a lipid moiety. In one example, a cationic amine moiety and a polyanion nucleic acid such as an mRNA interact electrostatically to form a positively charged liposome or lipid membrane structure. Thus, uptake of the nucleic acid into cells is promoted and nucleic acids are delivered into cells effectively.

[0045] In another aspect, the present disclosure refers to a lipid nanoparticle for delivering a nucleic acid, comprising the ionizable lipid having the structure of Formula I. The lipid nanoparticle comprises the ionizable lipid having the structure of Formula I, including any of the aspects or examples herein.

[0046] As used herein, the term "nucleic acid" refers to a polymer containing at least two deoxyribonucleotides or ribonucleotides in either single-or double-stranded form and includes DNA and RNA. DNA may be in the form of, e.g., antisense molecules, plasmid DNA, pre-condensed DNA, a PCR product, vectors (P1, PAC, BAC, YAC, artificial chromosomes) , expression cassettes, chimeric sequences, chromosomal DNA, or derivatives and combinations of these groups. RNA may be in the form of siRNA, asymmetrical interfering RNA (aiRNA) , microRNA (miRNA) , messenger RNA (mRNA) , tRNA, rRNA, tRNA, viral RNA (vRNA) , and combinations thereof. Nucleic acids include nucleic acids containing known nucleotide analogs or modified backbone residues or linkages, which are synthetic, naturally occurring, and non-naturally occurring, and which have similar binding properties as the reference nucleic acid. Examples of such analogs include, without limitation, phosphorothioates, phosphoramidates, methyl phosphonates, chiral-methyl phosphonates, T-O-methyl ribonucleotides, and peptide-nucleic acids (PNAs) . Unless specifically limited, the term encompasses nucleic acids containing known analogues of natural nucleotides that have similar binding properties as the reference nucleic acid. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence also implicitly encompasses conservatively modified variants thereof (e.g., degenerate codon substitutions) , alleles, orthologs, SNPs, and complementary sequences as well as the sequence explicitly indicated. Specifically, degenerate codon substitutions may be achieved by generating sequences in which the third position of one or more selected (or all) codons is substituted with mixed-base and / or deoxyinosine residues. "Nucleotides" contain a sugar deoxyribose (DNA) or ribose (RNA) , a base, and a phosphate group. Nucleotides are linked together through the phosphate groups. "Bases" include purines and pyrimidines, which  further include natural compounds adenine, thymine, guanine, cytosine, uracil, inosine, and natural analogs, and synthetic derivatives of purines and pyrimidines, which include, but are not limited to, modifications which place new reactive groups such as, but not limited to, amines, alcohols, thiols, carboxylates, and alkylhalides.

[0047] In one particular example, the nucleic acid is messenger RNA (mRNA) . A messenger RNA is typically a single-stranded RNA, which is composed of (at least) several structural elements, e.g. an optional 5′ UTR region, an optional upstream positioned ribosomal binding site followed by a coding region, an optional 3′ UTR region, which may be followed by a poly-Atail (and / or a poly-C tail) . In one example, one mRNA may encode one or more antigens. In another example, a coding region for each of a plurality of antigens may be located on separate mRNAs.

[0048] As used herein, the term "lipid" refers to a group of organic compounds that include, but are not limited to, esters of fatty acids and are characterized by being insoluble in water, but soluble in many organic solvents. A "lipid nanoparticle" is used herein to refer to a lipid formulation that can be used to deliver an active agent or therapeutic agent, such as a nucleic acid (e.g., an mRNA) , to a target site of interest. In the lipid nanoparticle of the invention, the active agent or therapeutic agent such as a nucleic acid (e.g., an mRNA) may be encapsulated in the lipid, thereby protecting the agent from enzymatic degradation. In one example, the nucleic acid can be fully encapsulated in the ionizable lipid formed nanoparticles. In another example, the nucleic acid can be partially encapsulated in the ionizable lipid formed nanoparticles. In another example, the nucleic acid can be both fully and partially encapsulated in the ionizable lipid formed nanoparticles.

[0049] The lipid nanoparticle as disclosed herein comprises the ionizable lipid having the structure of Formula I as disclosed herein, a non-ionizable lipid, and a PEG-conjugated lipid. In one example, the non-ionizable lipid is selected from the group consisting of a phospholipid and cholesterol. Representative examples ofphospholipids include, but are not limited to distearoylphosphatidylcholine (1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) , 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) , 1-hexadecanoyl-2-- (9Z-octadecenoyl) -sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) , and 1, 2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DHPC) .

[0050] Phospholipid and cholesterol are non-ionizable lipid or "neutral lipid" . As used herein, "non-ionizable lipid" or "neutral lipid" refers to any of a number of lipid species that exist either in an uncharged or neutral zwitterionic form at a selected pH range such as at physiological pH. Such non-ionizable lipids include, for example, diacyl phosphatidylcholine, diacyl phosphatidylethanolamine, ceramide, sphingomyelin, cephalin, cholesterol, cerebrosides, diacylglycerols, β-Sitosterol, desmosterol, lanosterol, zymosterol and fucosterol.

[0051] In one example, the PEG-conjugated lipid is selected from the group consisting of 1, 2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2000) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) -2000] (DSPE-PEG2000) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine-PEG2K (DSPC-PEG2000) , distearoyl-rac-glycerol-PEG2K (DSG-PEG 2000) and N-palmitoyl-sphingosine-1- {succinyl [methoxy (polyethylene glycol) 2000] (C16 PEG2000) . Conjugation of PEG to a lipid inhibits aggregation of lipid particles. Other examples of such lipid conjugates include, but are not limited to, polyamide oligomers (e.g., ATTA-lipid conjugates) , PEG-lipid conjugates, such as PEG coupled to dialkyloxypropyls, PEG coupled to diacylglycerols, PEG coupled to cholesterol, PEG coupled to phosphatidylethanolamines, PEG conjugated to ceramides, cationic PEG lipids, and mixtures thereof. PEG can be conjugated directly to the lipid or may be linked to the lipid via a linker moiety. Any linker moiety suitable for coupling the PEG to a lipid can be used including, e.g., non-ester containing linker moieties and ester-containing linker moieties. In preferred embodiments, non-ester containing linker moieties are used.

[0052] For the lipid nanoparticle as disclosed herein, the ionizable lipid having the structure of Formula I as disclosed herein comprises from 5 mol %to 70 mol %of the total lipid present in the nanoparticle. In one example, the ionizable lipid having the structure of Formula I as disclosed herein comprises about 5 mol %, about 10 mol %, about 15 mol %, about 20 mol %, about 25 mol %, about 30 mol %, about 35 mol %, about 40 mol %, about 45 mol %, about 50 mol %, about 55 mol %, about 60 mol %, about 65 mol %, or about 70 mol %of the total lipid present in the nanoparticle. In another example, the ionizable lipid having the structure of Formula I as disclosed herein comprises from 10 mol %to 65 mol %, from 15 mol %to 60 mol %, from 20 mol %to 55 mol %, from 25 mol %to 50 mol %, from 30 mol %to 45 mol %, from 5 mol %to 15 mol %, from 10 mol %to 20 mol %, from 15 mol %to 25 mol %, from 20 mol %to 30 mol %, from 25 mol %to 35 mol %, from 30  mol %to 40 mol %, from 35 mol %to 45 mol %, from 40 mol %to 50 mol %, from 45 mol %to 55 mol %, from 50 mol %to 60 mol %, from 55 mol %to 65 mol %, or from 60 mol %to 70 mol %of the total lipid present in the nanoparticle.

[0053] For the lipid nanoparticle as disclosed herein, the non-ionizable lipid comprises from 10 mol %to 90 mol %of the total lipid present in the nanoparticle. In one example, the non-ionizable lipid comprises about 10 mol %, about 15 mol %, about 20 mol %, about 25 mol %, about 30 mol %, about 35 mol %, about 40 mol %, about 45 mol %, about 50 mol %, about 55 mol %, about 60 mol %, about 65 mol %, about 70 mol %, about 75 mol %, about 80 mol %, about 85 mol %, or about 90 mol %of the total lipid present in the nanoparticle. In another example, the non-ionizable lipid comprises from 15 mol %to 85 mol %, from 20 mol %to 80 mol %, from 25 mol %to 75 mol %, from 30 mol %to 70 mol %, from 35 mol %to 65 mol %, from 40 mol %to 60 mol %, from 45 mol %to 55 mol %, from 10 mol %to 20 mol %, from 15 mol %to 25 mol %, from 20 mol %to 30 mol %, from 25 mol %to 35 mol %, from 30 mol %to 40 mol %, from 35 mol %to 45 mol %, from 40 mol %to 50 mol %, from 45 mol %to 55 mol %, from 50 mol %to 60 mol %, from 55 mol %to 65 mol %, from 60 mol %to 70 mol %, from 65 mol %to 75 mol %, from 70 mol %to 80 mol %, from 75 mol %to 85 mol %, or from 80 mol %to 90 mol %of the total lipid present in the nanoparticle.

[0054] For the lipid nanoparticle as disclosed herein, the phospholipid comprises from 5 mol %to 70 mol %of the total lipid present in the nanoparticle, and the cholesterol comprises from 5 mol %to 70 mol %of the total lipid present in the nanoparticle. In one example, the phospholipid comprises about 5 mol %, about 10 mol %, about 15 mol %, about 20 mol %, about 25 mol %, about 30 mol %, about 35 mol %, about 40 mol %, about 45 mol %, about 50 mol %, about 55 mol %, about 60 mol %, about 65 mol %, or about 70 mol %of the total lipid present in the nanoparticle. In another example, the phospholipid comprises 10 mol %to 65 mol %, from 15 mol %to 60 mol %, from 20 mol %to 55 mol %, from 25 mol %to 50 mol %, from 30 mol %to 45 mol %, from 5 mol %to 15 mol %, from 10 mol %to 20 mol %, from 15 mol %to 25 mol %, from 20 mol %to 30 mol %, from 25 mol %to 35 mol %, from 30 mol %to 40 mol %, from 35 mol %to 45 mol %, from 40 mol %to 50 mol %, from 45 mol %to 55 mol %, from 50 mol %to 60 mol %, from 55 mol %to 65 mol %, or from 60 mol %to 70 mol %of the total lipid present in the nanoparticle. In one example, the cholesterol comprises about 5 mol %, about 10 mol %, about 15 mol %, about 20 mol %, about 25 mol %, about 30 mol %, about 35 mol %, about  40 mol %, about 45 mol %, about 50 mol %, about 55 mol %, about 60 mol %, about 65 mol %, or about 70 mol %of the total lipid present in the nanoparticle. In another example, the cholesterol comprises from 10 mol %to 65 mol %, from 15 mol %to 60 mol %, from 20 mol %to 55 mol %, from 25 mol %to 50 mol %, from 30 mol %to 45 mol %, from 5 mol %to 15 mol %, from 10 mol %to 20 mol %, from 15 mol %to 25 mol %, from 20 mol %to 30 mol %, from 25 mol %to 35 mol %, from 30 mol %to 40 mol %, from 35 mol %to 45 mol %, from 40 mol %to 50 mol %, from 45 mol %to 55 mol %, from 50 mol %to 60 mol %, from 55 mol %to 65 mol %, or from 60 mol %to 70 mol %of the total lipid present in the nanoparticle.

[0055] For the lipid nanoparticle as disclosed herein, the PEG-conjugated lipid comprises from 1 mol %to 10 mol %of the total lipid present in the nanoparticle. In one example, the PEG-conjugated lipid comprises about 1 mol %, about 2 mol %, about 3 mol %, about 4 mol %, about 5 mol %, about 6 mol %, about 7 mol %, about 8 mol %, about 9 mol %, or about 10 mol %of the total lipid present in the nanoparticle. In another example, the PEG-conjugated lipid comprises from 2 mol %to 9 mol %, from 3 mol %to 8 mol %, from 4 mol %to 6 mol %, from 1 mol %to 3 mol %, from 2 mol %to 4 mol %, from 3 mol %to 5 mol %, from 4 mol %to 6 mol %, from 5 mol %to 7 mol %, from 6 mol %to 8 mol %, from 7 mol %to 9 mol %, or from 8 mol %to 10 mol %of the total lipid present in the nanoparticle.

[0056] In one example, the lipid nanoparticle as disclosed herein comprises the ionizable lipid having the structure of Formula I as disclosed herein, DSPC, cholesterol, and DMG-PEG2000. In another example, the molar ratio of the ionizable lipid having the structure of Formula I as disclosed herein, DSPC, cholesterol and DMG-PEG2000 is 50: 10: 38.5: 1.5.

[0057] In another aspect, the present disclosure refers to a nucleic acid-lipid nanoparticle comprising: (a) a nucleic acid; and (b) the lipid nanoparticle as disclosed herein.

[0058] Nucleic acid-lipid nanoparticles are extremely useful for systemic applications, as they can exhibit extended circulation lifetimes following intravenous (i. v. ) injection, they can accumulate at distal sites (e.g., sites physically separated from the administration site) , and they can mediate expression of the transfected gene or silencing of target gene expression at these distal sites. In one example, the nucleic acid comprises a messenger RNA (mRNA) . In one example, the nucleic acid is fully encapsulated in the nucleic acid-lipid nanoparticle thereby protected from enzymatic degradation such as by nuclease. In one example, the nucleic acid is partially encapsulated with the nucleic acid-lipid nanoparticle.  In another example, the nucleic acid is both fully and partially encapsulated in the nucleic acid-lipid nanoparticle. In another example, the nucleic acid-lipid nanoparticles are substantially non-toxic to mammals such as humans.

[0059] Typically, the nucleic acid-lipid nanoparticle of the invention has a lipid: nucleic acid mass ratio of from 1: 100 to 200: 1. In some examples, the nucleic acid-lipid nanoparticle of the invention has a lipid: nucleic acid mass ratio which ranges from 1: 90 to 190: 1, from 1: 80 to 180: 1, from 1: 70 to 170: 1, from 1: 60 to 160: 1, from 1: 50 to 150: 1, from 1: 40 to 140: 1, from 1: 30 to 130: 1, from 1: 20 to 120: 1, from 1: 10 to 110: 1, from 1: 9 to 100: 1, from 1: 8 to 90: 1, from 1: 7 to 80: 1, from 1: 6 to 70: 1, from 1: 5 to 60: 1, from 1: 4 to 50: 1, from 1: 3 to 40: 1, from 1: 2 to 30: 1, from 1: 1 to 20: 1, or from 5: 1 to 15: 1. In some examples, the nucleic acid-lipid nanoparticle of the invention has a lipid: nucleic acid mass ratio of about 1: 100, about 1: 90, about 1: 80, about 1: 70, about 1: 60, about 1: 50, about 1: 40, about 1: 30, about 1: 20, about 1: 10, about 1: 9, about 1: 8, about 1: 7, about 1: 6, about 1: 5, about 1: 4, about 1: 3, about 1: 2, about 1: 1, about 2: 1, about 3: 1, about 4: 1, about 5: 1, about 6: 1, about 7: 1, about 8: 1, about 9: 1, about 10: 1, about 11: 1, about 12: 1, about 13: 1, about 14: 1, about 15: 1, about 16: 1, about 17: 1, about 18: 1, about 19: 1, about 20: 1, about 30: 1, about 40: 1, about 50: 1, about 60: 1, about 70: 1, about 80: 1, about 90: 1, about 100: 1, about 110: 1, about 120: 1, about 130: 1, about 140: 1, about 150: 1, about 160: 1, about 170: 1, about 180: 1, about 190: 1, and about 200: 1 (or any fraction thereof or range therein) .

[0060] The nucleic acid-lipid nanoparticle of the invention typically has a mean diameter of from 40 nm to 300 nm. In one example, the nucleic acid-lipid nanoparticle of the invention has a mean diameter of from 50 nm to 290 nm, from 60 nm to 280 nm, from 70 nm to 270 nm, from 80 nm to 260 nm, from 90 nm to 250 nm, from 100 nm to 240 nm, from 110 nm to 230 nm, from 120 nm to 220 nm, from 130 nm to 210 nm, from 140 nm to 200 nm, from 150 nm to 190 nm, from 160 nm to 180 nm, from 40 nm to 60 nm, from 50 nm to 70 nm, from 60 nm to 80 nm, from 70 nm to 90 nm, from 80 nm to 100 nm, from 90 nm to 110 nm, from 100 nm to 120 nm, from 110 nm to 130 nm, from 120 nm to 140 nm, from 130 nm to 150 nm, from 140 nm to 160 nm, from 150 nm to 170 nm, from 180 nm to 200 nm, from 190 nm to 210 nm, from 200 nm to 220 nm, from 210 nm to 230 nm, from 220 nm to 240 nm, from 230 nm to 250 nm, from 240 nm to 260 nm, from 250 nm to 270 nm, from 260 nm to 280 nm, from 270 nm to 290 nm, from 280 nm to 300 nm. In another example, the nucleic acid-lipid nanoparticle of the invention has a mean diameter of about 40 nm, about 50 nm, about 60 nm, about 70 nm, about 80 nm, about 90 nm, about 100 nm,  about 110 nm, about 120 nm, about 130 nm, about 140 nm, about 150 nm, about 160 nm, about 170 nm, about 180 nm, about 190 nm, about 200 nm, about 210 nm, about 220 nm, about 230 nm, about 240 nm, about 250 nm, about 260 nm, about 270 nm, about 280 nm, about 190 nm, or about 300 nm. The nucleic acid-lipid nanoparticle of the invention are substantially non-toxic. In addition, nucleic acids, when present in the lipid particles of the invention, are resistant in aqueous solution to degradation with a nuclease. Nucleic acid-lipid particles and their method of preparation are commonly known in the field, such as the methods disclosed in, U.S. Patent Publication Nos. 20040142025 and 20070042031, and WO2016004318A1.

[0061] Polydispersity Index (PdI Index) is a parameter to define the particle size distribution of nanoparticles, which is expressed as dimensionless number extrapolated from autocorrelation function in photon correlation spectroscopy. The value of Polydispersity Index may vary from 0.01 (mono dispersed particles) to 0.5-0.7, whereas, PDI Index value ＞ 0.7 indicated broad particle size distribution of the formulation. The particle size and particle size distribution are very critical factors for performance evaluation of nanoparticles. Significant variations are observed in drug loading, encapsulation efficiency, bioavailability and efficacy of the nano-formulations with wide particle size distribution. Smaller PdI means that the particle size distribution of the obtained nucleic acid-lipid nanoparticles is narrower, effectively reducing the number of large particles, and meeting the requirement of in vivo delivery. Detecting the particle size and PdI of the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein can be done by using a dynamic light scattering instrument. In one example, the nucleic acid-lipid nanoparticle of the present invention comprises a polydispersity index (PdI) from 0.1 to 0.3, indicating that it is a mono dispersed nanoparticle. In another example, the nucleic acid-lipid nanoparticle of the present invention comprises a PdI of about 0.1, about 0.15, about 0.2, about 0.25, or about 0.3, or less than 0.3, 0.29, 0.28, 0.27, 0.26, 0.25, 0.24, 0.23, 0.22, 0.21, 0.20, 0.19, 0.18, 0.17, 0.16, 0.15, 0.14, 0.13, 0.12, 0.11, or 0.10.

[0062] The nucleic acid-lipid nanoparticle of the invention is serum-stable, meaning that the nucleic acid-lipid nanoparticle is not significantly degraded after exposure to a serum or nuclease assay that would significantly degrade free nucleic acids such as free mRNA. Suitable assays include, for example, a standard serum assay, a DNAse assay, or an RNAse assay.

[0063] In another aspect, the present disclosure refers to a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0064] In another aspect, the present disclosure refers to an immunogenic composition comprising the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and / or adjuvant.

[0065] As used herein, "immunogenic composition" refers to a composition comprising the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein, which possesses the ability to solicit an immune response in vitro, or in vivo after administration into the body of a subject.

[0066] The carriers, diluents and adjuvants must be "acceptable" in terms of being compatible with the other ingredients of the composition, and not deleterious to the recipient thereof.

[0067] Examples of pharmaceutically acceptable carriers or diluents are demineralised or distilled water; saline solution; vegetable based oils such as peanut oil, safflower oil, olive oil, cottonseed oil, maize oil, sesame oils such as peanut oil, safflower oil, olive oil, cottonseed oil, maize oil, sesame oil, arachis oil or coconut oil; silicone oils, including polysiloxanes, such as methyl polysiloxane, phenyl polysiloxane and methylphenyl polysolpoxane; volatile silicones; mineral oils such as liquid paraffin, soft paraffin or squalane; cellulose derivatives such as methyl cellulose, ethyl cellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose or hydroxypropylmethylcellulose; lower alkanols, for example ethanol or iso-propanol; lower aralkanols; lower polyalkylene glycols or lower alkylene glycols, for example polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, propylene glycol, 1, 3-butylene glycol or glycerin; fatty acid esters such as isopropyl palmitate, isopropyl myristate or ethyl oleate; polyvinylpyrolidone; agar; gum tragacanth or gum acacia, and petroleum jelly. Typically, the carrier or carriers will form from 10%to 99.9%by weight of the compositions.

[0068] The pharmaceutical or immunogenic compositions of the invention may be in a form suitable for administration by injection, in the form of a formulation suitable for oral ingestion (such as capsules, tablets, caplets, elixirs, for example) , in the form of an ointment, cream or lotion suitable for topical administration, in a form suitable for delivery as an eye drop, in an aerosol form suitable for administration by inhalation, such as by intranasal inhalation or oral inhalation, in a form suitable for parenteral administration, that is, subcutaneous, intramuscular or intravenous injection.

[0069] For administration as an injectable solution or suspension, non-toxic parenterally acceptable diluents or carriers can include, Ringer′s solution, isotonic saline, phosphate buffered saline, ethanol and 1, 2 propylene glycol.

[0070] Methods for preparing parenterally administrable compositions are apparent to those skilled in the art, and are described in more detail in, for example, Remington′s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., hereby incorporated by reference herein.

[0071] Some examples of suitable carriers, diluents, excipients and adjuvants for oral use include peanut oil, liquid paraffin, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, sodium alginate, gum acacia, gum tragacanth, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, gelatine and lecithin. In addition these oral formulations may contain suitable flavouring and colourings agents. When used in capsule form the capsules may be coated with compounds such as glyceryl monostearate or glyceryl distearate which delay disintegration.

[0072] Adjuvants typically include emollients, emulsifiers, thickening agents, preservatives, bactericides and buffering agents.

[0073] Solid forms for oral administration may contain binders acceptable in human and veterinary pharmaceutical practice, sweeteners, disintegrating agents, diluents, flavourings, coating agents, preservatives, lubricants and / or time delay agents. Suitable binders include gum acacia, gelatine, corn starch, gum tragacanth, sodium alginate, carboxymethylcellulose or polyethylene glycol. Suitable sweeteners include sucrose, lactose, glucose, aspartame or saccharine. Suitable disintegrating agents include corn starch, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, guar gum, xanthan gum, bentonite, alginic acid or agar. Suitable diluents include lactose, sorbitol, mannitol, dextrose, kaolin, cellulose, calcium carbonate, calcium silicate or dicalcium phosphate. Suitable flavouring agents include peppermint oil, oil of wintergreen, cherry, orange or raspberry flavouring. Suitable coating agents include polymers or copolymers of acrylic acid and / or methacrylic acid and / or their esters, waxes, fatty alcohols, zein, shellac or gluten. Suitable preservatives include sodium benzoate, vitamin E, alpha-tocopherol, ascorbic acid, methyl paraben, propyl paraben or sodium bisulphite. Suitable lubricants include magnesium stearate, stearic acid, sodium oleate, sodium chloride or talc. Suitable time delay agents include glyceryl monostearate or glyceryl distearate.

[0074] Liquid forms for oral administration may contain, in addition to the above agents, a liquid carrier. Suitable liquid carriers include water, oils such as olive oil, peanut oil,  sesame oil, sunflower oil, safflower oil, arachis oil, coconut oil, liquid paraffin, ethylene glycol, propylene glycol, polyethylene glycol, ethanol, propanol, isopropanol, glycerol, fatty alcohols, triglycerides or mixtures thereof.

[0075] Suspensions for oral administration may further comprise dispersing agents and / or suspending agents. Suitable suspending agents include sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxypropylmethyl-cellulose, poly-vinyl-pyrrolidone, sodium alginate or acetyl alcohol. Suitable dispersing agents include lecithin, polyoxyethylene esters of fatty acids such as stearic acid, polyoxyethylene sorbitol mono-or di-oleate, -stearate or -laurate, polyoxyethylene sorbitan mono-or di-oleate, -stearate or -laurate and the like.

[0076] The emulsions for oral administration may further comprise one or more emulsifying agents. Suitable emulsifying agents include dispersing agents as exemplified above or natural gums such as guar gum, gum acacia or gum tragacanth.

[0077] In one example, for the immunogenic composition comprising the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein, the nucleic acid is an mRNA encoding an antigen (or a fragment thereof) associated with a disease selected from the group consisting of an infection and a cancer. Upon administration of the immunogenic composition into the body of a subject, the mRNA will be expressed into a functional peptide or protein which is an antigen (or a fragment thereof) associated with a disease selected from the group consisting of an infection and a cancer, which will then elicit an immune response in the body of the subject, to therefore prevent or treat the disease selected from the group consisting of an infection and a cancer. In other words, the immunogenic composition can function as a vaccine. As used herein, the term “vaccine” includes an agent which may be used to stimulate the immune system of a subject. In this way, immune protection may be provided against an antigen not recognized as a self-antigen by the immune system.

[0078] The mRNA may encode an antigen (or a fragment thereof) associated with an infection caused by a bacterium, a virus, an archaea, a protozoa, a fungi, an algae, a slime mode, a lichen, and a prion. In one particular example, the mRNA encodes nucleoprotein (NP) of an influenza virus. Influenza virus nucleoprotein (NP) is a major structural protein in virus particles and has multiple functions in the viral infectious cycle. Influenza virus NP has been validated as an attractive influenza vaccine with broad protection effect by eliciting robust T cell responses.

[0079] Examples of the bacterium an antigen of which is encoded by the mRNA as disclosed herein can be a Gram-positive bacterium or a Gram-negative bacterium. In one example, the bacterium is selected from the group consisting of Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium difficile and Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheria, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus infiuenzae, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, and Vibrio cholera, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella canis, Brucella ovis, Brucella neotomae, Mycoplasma mycoides, Clostridium perfringens, Mycobacterium avium Salmonella spp., Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Yersinia pestis, Francisella tularensis, Bacillus anthracis, Coxiella burnetiid, Listeria monocytogenes, Clostridium chauvoei, Campylobacter spp., Chlamydia psittaci, Anaplasma marginale, Leptospira spp. Causes leptospirosis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium perfringens, Staphylococcus intermedius, Bartonella henselae, Chlamydophila felis, Mycoplasma spp, Pasteurella multocida, Erwinia amylovora, Xanthomonas spp., Xanthomonas axonopodis, Ralstonia solanacearum, Pectobacterium and Dickeya spp., Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae, Pseudomonas syringae pv. lachrymans, Xanthomonas campestris pv. campestris, Xanthomonas oryzae, Clavibacter michiganensis, Xylella fastidiosa, Pantoea spp., Burkholderia glumae, Xanthomonas cirri, Xanthomonas translucens, Xanthomonas fragariae, Xanthomonas hortorum, Clavibacter michiganensis, Pseudomonas syringae or a combination thereof.

[0080] Examples of the virus an antigen of which is encoded by the mRNA as disclosed herein can be selected from a group consisting of a double-stranded DNA virus, a single-stranded DNA virus, a double-stranded RNA virus, a positive sense RNA virus, a negative sense RNA virus, and a retrovirus. In one example, the virus selected from the group consisting of an influenza virus (including an influenza A or influenza B) , a coronavirus such as SARS-CoV-2, an Ebola virus, measles, SARS, Chikungunya virus, Marburg, MERS, Dengue, Lassa, rhabdovirus, HIV, a hepatitis virus (including hepatitis A, B, C, D,  or E) , a human respiratory syncytial virus, Sudan ebola virus, Bundibugyo virus, Tai Forest ebola virus, Reston ebola virus, Achimota virus, Aedes flavivirus, Aguacate virus, Akabane virus, Alethinophid reptarenavirus, Allpahuayo mammarenavirus, Amapari mmarenavirus, Andes virus, Apoi virus, Aravan virus, Aroa virus, Arumwot virus, Atlantic salmon paramyxovirus, Australian bat lyssavirus, Avian bomavirus, Avian metapneumovirus, Avian paramyxoviruses, penguin or Falkland Islandsvirus, BK polyomavirus, Bagaza virus, Banna virus, Bat herpesvirus, Bat sapovirus, Bear Canon mammarenavirus, Beilong virus, Betacoronavirus, Betapapillomavirus 1-6, Bhanja virus, Bokeloh bat lyssavirus, Boma disease virus, Bourbon virus, Bovine hepacivirus, Bovine parainfluenza virus 3, Bovine respiratory syncytial virus, Brazoran virus, Bunyamwera virus, Caliciviridae virus. California encephalitis virus, Candiru virus, Canine distemper virus, Canine pneumovirus, Cedar virus, Cell fusing agent virus, Cetacean morbillivirus, Chandipura virus, Chaoyang virus, Chapare mammarenavirus, Colobus monkey papillomavirus, Colorado tick fever virus, Cowpox virus, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Culex flavivirus, Cupixi mammarenavirus, Dengue virus, Dobrava-Belgrade virus, Donggang virus, Dugbe virus, Duvenhage virus, Eastern equine encephalitis virus, Entebbe bat virus, Enterovirus A-D, European bat lyssavirus 1-2, Eyach virus, Feline morbillivirus, Fer-de- Lance paramyxovirus, Fitzroy River virus, Flaviviridae virus, Flexal mammarenavirus, GB virus C, Gairo virus, Gemycircularvirus, Goose paramyxovirus SF02, Great Island virus, Guanarito mammarenavirus, Hantaan virus, Hantavirus Z 10, Heartland virus, Hendra virus, Hepatitis A / B / C / E, Hepatitis delta virus, Human bocavirus, Human coronavirus, Human endogenous retrovirus K, Human enteric coronavirus, Human genital-associated circular DNA virus- 1, Human herpesvirus 1-8, Human mastadenovirus A-G, Human papillomavirus, Human parainfluenza virus 1-4, Human paraechovirus, Human picomavirus, Human smacovirus, Ikoma lyssavirus, Ilheus virus, Influenza A-C, Ippy mammarenavirus, Irkut virus, J-virus, JC polyomavirus, Japanese encephalitis virus, Junin mammarenavirus, KI polyomavirus, Kadipiro virus, Kamiti River virus, Kedougou virus, Khujand virus, Kokobera virus, Kyasanur forest disease virus, Lagos bat virus, Langat virus, Lassa mammarenavirus, Latino mammarenavirus, Leopards Hill virus, Liao ning virus, Ljungan virus, Lloviu virus, Louping ill virus, Lujo mammarenavirus, Luna mammarenavirus, Lunk virus, Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus, Lyssavirus Ozemoe, MSSI2Y225 virus, Machupo mammarenavirus, Mamastrovirus 1, Manzanilla virus, Mapuera virus, Marburg virus, Mayaro virus, Measles virus, Menangle virus,  Mercadeo virus, Merkel cell polyomavirus, Middle East respiratory syndrome coronavirus, Mobala mammarenavirus, Modoc virus, Moijang virus, Mokolo virus, Monkeypox virus, Montana myotis leukoenchalitis virus, Mopeia lassa virus reassortant 29, Mopeia mammarenavirus, Morogoro virus, Mossman virus, Mumps virus, Murine pneumonia virus, Murray Valley encephalitis virus, Nariva virus, Newcastle disease virus, Nipah virus, Norwalk virus, Norway rat hepacivirus, Ntaya virus, O′nyong-nyong virus, Oliveros mammarenavirus, Omsk hemorrhagic fever virus, Oropouche virus, Parainfluenza virus 5, Parana mammarenavirus, Parramatta River virus, Peste-des-petits-ruminants virus, Pichande mammarenavirus, Picomaviridae virus, Pirital mammarenavirus, Piscihepevirus A, Porcine parainfluenza virus 1, porcine rubulavirus, Powassan virus, Primate T-lymphotropic virus 1-2, Primate erythroparvovirus 1, Punta Toro virus, Puumala virus, Quang Binh virus, Rabies virus, Razdan virus, Reptile bomavirus 1, Rhinovirus A-B, Rift Valley fever virus, Rinderpest virus, Rio Bravo virus, Rodent Torque Teno virus, Rodent hepacivirus, Ross River virus, Rotavirus A-I, Royal Farm virus, Rubella virus, Sabia mammarenavirus, Salem virus, Sandfly fever Naples virus, Sandfly fever Sicilian virus, Sapporo virus, Sathuperi virus, Seal anellovirus, Semliki Forest virus, Sendai virus, Seoul virus, Sepik virus, Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus, Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, Shamonda virus, Shimoni bat virus, Shuni virus, Simbu virus, Simian torque teno virus, Simian virus 40-41, Sin Nombre virus, Sindbis virus, Small anellovirus, Sosuga virus, Spanish goat encephalitis virus, Spondweni virus, St. Louis encephalitis virus, Sunshine virus, TTV-like mini virus, Tacaribe mammarenavirus, Taila virus, Tamana bat virus, Tamiami mammarenavirus, Tembusu virus, Thogoto virus, Thottapalayam virus, Tick-borne encephalitis virus, Tioman virus, Togaviridae virus, Torque teno canis virus, Torque teno douroucouli virus, Torque teno felis virus, Torque teno midi virus, Torque teno sus virus, Torque teno tamarin virus, Torque teno virus, Torque teno zalophus virus, Tuhoko virus, Tula virus, Tupaia paramyxovirus, Usutu virus, Uukuniemi virus, Vaccinia virus, Variola virus, Venezuelan Vesicular stomatitis Indiana virus, WU Polyomavirus, Wesselsbron virus, West Caucasian bat virus, West Nile virus, Western equine encephalitis virus, Whitewater Arroyo mammarenavirus, Yellow fever virus, Yokose virus, Yug Bogdanovac virus, Zaire ebolavirus, Zika virus, or Zygosaccharomyces bailii virus Z viral sequence, Canine Parvovirus, Canine Distemper Virus, Canine Coronavirus, Canine Influenza Virus, Feline Herpesvirus, Feline Calicivirus, Feline Leukemia Virus, Feline Immunodeficiency Virus, Canine Adenovirus -Type 1 and  Type 2, Canine Herpesvirus, Tobacco Mosaic Virus, Potato Virus Y, Tomato Spotted Wilt Virus, Cucumber Mosaic Virus, Potato Virus X, Barley Yellow Dwarf Virus, Bean Common Mosaic Virus, Maize Dwarf Mosaic Virus, Soybean Mosaic Virus, Citrus Tristeza Virus, Rice Yellow Mottle Virus, Plum Pox Virus, Turnip Mosaic Virus, Aphid-Transmitted Yellow Dwarf Viruses, Cotton Leaf Curl Virus, Papaya Ringspot Virus, Cassava Mosaic Virus, Rice Tungro Virus, Apple Mosaic Virus, Sugarcane Mosaic Virus or a combination thereof.

[0081] Examples of cancer an antigen of which is encoded by the mRNA as disclosed herein can be selected from the group consisting of a carcinoma, a sarcoma, a leukaemia, a lymphoma, a myeloma, a brain cancer, and a spinal cord cancer. Specifically the cancer can be selected from the group consisting of brain cancer, lung cancer, breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, blood cancer, skin cancer, colorectal cancer, colon cancer, rectal cancer, head and neck cancer, and oral cancer.

[0082] In one example, the pharmaceutical composition or immunogenic composition comprising the nucleic acid-lipid nanoparticle disclosed herein are lyophilized. For example, lyophilized pharmaceutical composition or immunogenic composition according to the invention may be reconstituted prior to administration or can be reconstituted in vivo. For example, a lyophilized pharmaceutical composition or immunogenic composition can be formulated in an appropriate dosage form (e.g., an intradermal dosage form such as a disk, rod or membrane) and administered such that the dosage form is rehydrated over time in vivo by the individual′s bodily fluids. In another example, the pharmaceutical composition or immunogenic composition comprising the nucleic acid-lipid nanoparticle disclosed herein are reconstituted lyophilized compositions.

[0083] In another aspect, the present disclosure refers to an in vitro method for introducing a nucleic acid into a cell, the method comprising contacting the cell with the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein.

[0084] The contacting of the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein with the cells is carried out for a period of time sufficient for delivery of the nucleic acid to the cells to occur, for example 1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 40 min, 50 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h, 15 h, 18 h, 24 h, 36 h, 48 h, 72 h, or more. The nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein can be adsorbed to almost any cell type with which they are mixed or contacted. Once adsorbed, the nucleic acid-lipid nanoparticle as  disclosed herein can either be endocytosed by a portion of the cells, exchange lipids with cell membranes, or fuse with the cells. Transfer or incorporation of the nucleic acid portion of the nanoparticle can take place via any one of these pathways. In particular, when fusion takes place, the particle membrane is integrated into the cell membrane and the contents of the particle combine with the intracellular fluid. In one example, the cell is selected from the group consisting of an epithelial cell, a hematopoietic cell, epithelial cells, an endothelial cell, a lung cell, a hepatocyte, a bone cell, a stem cell, a mesenchymal cell, a neural cell, a cardiac cell, a cardiomyocyte, an adipocyte, a vascular smooth muscle cell, a skeletal muscle cell, a beta cell, a pituitary cell, a synovial lining cell, an ovarian cell, a testicular cell, a fibroblast, a B cell, a T cell, a dendritic cell, a reticulocyte, a leukocyte, a granulocyte and a tumor cell.

[0085] In one example, the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein contemplates the use of targeting ligands capable of enhancing the affinity of the nanoparticle to one or more target cells. In another example, the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein does not comprise a targeting ligand.

[0086] In another aspect, the present disclosure refers to a method for the in vivo delivery of a nucleic acid, the method comprising administering to a subject a nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein.

[0087] As used herein, the term "subject" refers to patients of human or other mammal and includes any individual it is desired to examine or treat using the nucleic acid-lipid nanoparticles, pharmaceutical or immunogenic compositions, or methods of the invention. However, it will be understood that “patient” does not imply that symptoms are present. Suitable mammals that fall within the scope of the invention include, but are not restricted to, primates, livestock animals (e.g. sheep, cows, horses, donkeys, pigs) , laboratory test animals (e.g. rabbits, mice, rats, guinea pigs, hamsters) , companion animals (e.g. cats, dogs) and captive wild animals (e.g. foxes, deer, dingoes) . "Mammal" refers to any animal classified as a mammal, including humans, domestic and farm animals, and zoo, sports, and pet companion animals such as a household pet and other domesticated animal such as, but not limited to, cattle, sheep, ferrets, swine, horses, poultry, rabbits, goats, dogs, cats and the like. Preferably, the mammalian subject is human.

[0088] In one example, the mode of administration of the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein, or the pharmaceutical / immunogenic compositions thereof includes, but is not limited to, oral, intranasal, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarticular,  intralesional, intratracheal, subcutaneous, and intradermal. In one particular example, the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein is administered intramuscularly.

[0089] Formulations suitable for parenteral administration, for example, by intraarticular (in the joints) , intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, and subcutaneous routes, include aqueous and non-aqueous, isotonic sterile injection solutions, which can contain antioxidants, buffers, bacteriostats, and solutes that render the formulation isotonic with the blood of the intended recipient, and aqueous and non-aqueous sterile suspensions that can include suspending agents, solubilizers, thickening agents, stabilizers, and preservatives.

[0090] In one example, after administration to the subject at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%or 95%of the total administered dose of nucleic acid-lipid nanoparticles is present in the plasma of the subject about 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, or 48 hours after injection. In another example, at least about 10%of the total administered dose of nucleic acid-lipid nanoparticle is present in the plasma of the subject about 6 hours after administration. In certain examples, the presence of the nucleic acid such as the mRNA delivered by the nucleic acid-lipid nanoparticle is detectable in a target cell selected from the group consisting of an epithelial cell, a hematopoietic cell, epithelial cells, an endothelial cell, a lung cell, a hepatocyte, a bone cell, a stem cell, a mesenchymal cell, a neural cell, a cardiac cell, a cardiomyocyte, an adipocyte, a vascular smooth muscle cell, a skeletal muscle cell, a beta cell, a pituitary cell, a synovial lining cell, an ovarian cell, a testicular cell, a fibroblast, a B cell, a T cell, a dendritic cell, a reticulocyte, a leukocyte, a granulocyte and a tumor cell, such as lung, liver, heart, tumor, immune cells, or at a site of infection or inflammation at about 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 or 96 hours after administration. In other examples, expression of a functional peptide or protein encoded by the mRNA is detectable at about 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 or 96 hours after administration. In other examples, the presence or effect of the nucleic acid such as mRNA in cells at a site proximal or distal to the site of administration or in cells such as cells of the lung, liver, skin, muscle, blood, or a tumor is detectable at about 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, or 96 hours, or at about 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26, or 28 days after administration.

[0091] The nucleic acid-lipid nanoparticles or pharmaceutical / immunogenic compositions thereof can be sterilized by conventional liposomal sterilization techniques, such as filtration. The nucleic acid-lipid nanoparticles or pharmaceutical / immunogenic  compositions thereof may contain pharmaceutically acceptable auxiliary substances as required to approximate physiological conditions, such as pH adjusting and buffeting agents, tonicity adjusting agents, wetting agents and the like, for example, sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sorbitan monolaurate, triethanolamine oleate, etc. These nucleic acid-lipid nanoparticles or pharmaceutical / immunogenic compositions thereof can be sterilized using the techniques referred to above or, alternatively, they can be produced under sterile conditions. Additionally, the nanoparticle suspension may include lipid-protective agents which protect lipids against free-radical and lipid-peroxidative damages on storage. Lipophilic free-radical quenchers, such as alpha-tocopherol and water-soluble iron-specific chelators, such as ferrioxamine, are suitable. The resulting aqueous solutions may be packaged for use or filtered under aseptic conditions and lyophilized, the lyophilized preparation being combined with a sterile aqueous solution prior to administration. The lyophilized nanoparticles or pharmaceutical compositions or immunogenic compositions comprising the nucleic acid-lipid nanoparticles as disclosed herein may be reconstituted prior to administration or can be reconstituted in vivo. For example, a lyophilized pharmaceutical composition can be formulated in an appropriate dosage form (e.g., an intradermal dosage form such as a disk, rod or membrane) and administered such that the dosage form is rehydrated over time in vivo by the individual′s bodily fluids.

[0092] In one example, after administration into a subject, the nucleic acid-lipid nanoparticle achieves "systemic delivery" which refers to delivery of the nucleic acid-lipid nanoparticles that leads to a broad biodistribution of the nucleic acid such as mRNA within the subject. Systemic delivery means that a useful, preferably prophylactic or therapeutic, amount of an agent such as mRNA is exposed to most parts of the body. To obtain broad biodistribution generally requires a blood lifetime such that the nucleic acid and nanoparticle are not rapidly degraded or cleared (such as by first pass organs (liver, lung, etc. ) or by rapid, nonspecific cell binding before reaching a target site distal to the site of administration. Systemic delivery of the nucleic acid-lipid nanoparticles can be by any means known in the art including, for example, intravenous, subcutaneous, and intraperitoneal administration. In one example, systemic delivery of the nucleic acid-lipid nanoparticles is by intravenous delivery. In another example, after administration into a subject, the nucleic acid-lipid nanoparticle achieves "local delivery" which refers to delivery of the nucleic acid-lipid nanoparticles directly to a target site within the subject.  For example, an agent can be locally delivered by direct injection into a disease site such as a tumour site or other target site such as a site of infection or inflammation or a target organ such as the liver, heart, pancreas, kidney, and the like. In one example, local delivery of the nucleic acid-lipid nanoparticles is by intramuscular delivery.

[0093] In one example, after administration into a subject such as by intravenous injection, the nucleic acid-lipid nanoparticle is specifically delivered to the lung. As used herein, "specifically delivered to the lung" refers to more than 90%, more than 95%, more than 98%, more than 99%, or 100%of the nucleic acid-lipid nanoparticle administered into a subject being delivered to the lung. In another example, after intravenous administration into a subject, the nucleic acid-lipid nanoparticle is specifically delivered to the spleen. As used herein, "specifically delivered to the spleen" refers to more than 90%, more than 95%, more than 98%, more than 99%, or 100%of the nucleic acid-lipid nanoparticle administered into a subject being delivered to the spleen. Advantageously, since current commercial lipid nanoparticles (such as Modema, Pfizer) can only deliver mRNA to the liver, the LNP of the present invention can be specifically used for lung or spleen diseases treatment given the high delivery tendency to the lung or the spleen.

[0094] In one example, the nucleic acid-lipid nanoparticle being specifically delivered to the lung is lipid F11 (with headgroup F and alkyl tail 11 as shown in Figure 1) . The chemical structure of lipid F11 is shown in Formula III below.

[0095] In another example, the nucleic acid-lipid nanoparticle being specifically delivered to the spleen is lipid E9 (with headgroup E and alkyl tail 9 as shown in Figure 1) . The chemical structure of lipid E9 is shown in Formula IV below.

[0096] In another aspect, the present disclosure refers to a method of treating a subject having a disease caused by deficiency in a functional peptide or protein, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein or the pharmaceutical composition as disclosed herein, wherein the nucleic acid is a mRNA encoding the functional peptide or protein, wherein following administration the functional peptide or protein is expressed in a target cell.

[0097] In another aspect, the present disclosure refers to use of the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein or the pharmaceutical composition as disclosed herein in the manufacture of a medicament for treating a subject having a disease caused by deficiency in a functional peptide or protein, wherein the nucleic acid is a mRNA encoding the functional peptide or protein, wherein following administration the functional peptide or protein is expressed in a target cell.

[0098] As used herein, the term "treatment" or any grammatically equivalent terms thereof, refers to any and all uses which remedy a disease state or symptoms, prevent the establishment of disease, or otherwise prevent, hinder, retard, or reverse the progression of disease or other undesirable symptoms in any way whatsoever.

[0099] In one example, the target cell is selected from the group consisting of an epithelial cell, a hematopoietic cell, epithelial cells, an endothelial cell, a lung cell, a hepatocyte, a bone cell, a stem cell, a mesenchymal cell, a neural cell, a cardiac cell, a cardiomyocyte, an adipocyte, a vascular smooth muscle cell, a skeletal muscle cell, a beta  cell, a pituitary cell, a synovial lining cell, an ovarian cell, a testicular cell, a fibroblast, a B cell, a T cell, a dendritic cell, a reticulocyte, a leukocyte, a granulocyte and a tumor cell.

[0100] After administration of the nucleic acid-lipid nanoparticle or the pharmaceutical composition comprising the nucleic acid-lipid nanoparticle into the subject, the nanoparticle is taken up by a target cell and mRNA is translated into a functional peptide or protein. In some examples, the functional peptide or protein is produced by the target cell for sustained amounts of time. For example, the functional peptide or protein may be produced for more than one hour, more than four, more than six, more than 12, more than 24, more than 48 hours, or more than 72 hours after administration. In another example, the functional peptide or protein is expressed for a period of 1-7 days. In some examples the functional peptide or protein is expressed at a peak level about 1, 4, 6, 12, 24, 48, 72 hours, or 4, 5, 6, 7, 14, 21, 30, 40, 50, or 60 days after administration. In some examples the expression of the functional peptide or protein is sustained at least at a therapeutic level allowing remedy a disease state or symptoms, hinder, retard, or reverse the progression of disease or other undesirable symptoms. In some examples the functional peptide or protein is expressed at least a therapeutic level for more than one, more than four, more than six, more than 12, more than 24, more than 48 hours, or more than 72 hours, or 4, 5, 6, 7, 14, 21, 30, 40, 50, or 60 days after administration. In some examples the functional peptide or protein is detectable at the level in the subject′s serum or tissue (e.g., liver, or lung) . In some examples, the level of detectable functional peptide or protein is from continuous expression from the mRNA composition over periods of time of more than one, more than four, more than six, more than 12, more than 24, more than 48 hours, or more than 72 hours, or more than 4, 5, 6, 7, 14, 21, 30, 40, 50, or 60 days after administration.

[0101] In some examples, the functional peptide or protein is expressed by the target cell at a level which is at least 1-fold, at least 1.5 -fold, at least 2-fold, at least 5 -fold, at least 10-fold, at least 20-fold, 30-fold, at least 100-fold, at least 500-fold, at least 5000-fold, at least 50,000-fold or at least 100,000-fold greater than a control. As used herein, the control refers to a subject having a deficiency in the relevant functional peptide or protein who are not administered with the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein, or who are administered with the nucleic acid using a different carrier from the nanoparticle as disclosed herein. In some examples, the fold increase of expression greater than control is sustained for more than one, more than four, more than six, more than 12, more than 24, or more than 48 hours, or more than 72 hours, or more than 4, 5, 6, 7, 14, 21, 30, 40, 50, or 60  days after administration. In certain embodiments, the levels of functional peptide or protein are detectable at 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 18 h, 24 h, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, or 1 week or more after administration. Increased levels of protein may be observed in a body fluid, which may be chosen from, e.g., whole blood, a blood fraction such as the serum or plasma, or lymphatic fluid, and / or in a tissue (e.g. muscle, liver, lung) .

[0102] The disease caused by deficiency in a functional peptide or protein can be selected from the group consisting of an infection and a cancer. The nucleic acid-lipid nanoparticles, the pharmaceutical composition, methods or uses of the invention are useful in the management and treatment of a large number of diseases, in particular diseases which result from functional peptide or protein (such as a protein and / or enzyme) deficiencies. Individuals suffering from such diseases may have underlying genetic defects that lead to the compromised expression of a functional peptide or protein (such as a protein and / or enzyme) , including, for example, the non-synthesis of the functional peptide or protein, the reduced synthesis of the functional peptide or protein, or synthesis of a functional peptide or protein lacking or having diminished biological activity. The disease caused by deficiency in a functional peptide or protein can be selected from the group consisting of an infection and a cancer.

[0103] In some examples, the administration of the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein or the pharmaceutical composition as disclosed herein comprises a single or repeated doses. In some examples, the administration comprises about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 60, or more doses.

[0104] In some examples, the treatment by administration of the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein or the pharmaceutical composition as disclosed herein lasts a duration of about 1 day, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 1 week, about 1.5 weeks, about 2 weeks, about 3 weeks, about 4 weeks, about 2 months, about 3 months, about 4 months, about 5 months, about 6 months, about 7 months, about 8 months, about 9 months, about 10 months, about 11 months, about 12 months, or longer.

[0105] In some examples, the treatment by administration of the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein or the pharmaceutical composition as disclosed herein comprises administrating a dosage of the nucleic acid-lipid nanoparticle at about 0.001-5 mg / kg body weight, for example, 0.001-0.1, 0.01-0.5, 0.1-1.0, 0.5-1.5, 1.0-2.0, 1.5-2.5, 2.0-3.0, 2.5-3.5, 3.0-4.0, 3.5-4.5, 4.0-5.0, about 0.001, about 0.01, about 0.02, about 0.05, about  0.1, about 0.2, about 0.5, about 0.8, about 1.0, about 1.5, about 2.0, about 2.5, about 3.0, about 3.5, about 4.0, about 4.5 or about 5.0 mg / kg body weight.

[0106] In another aspect, the present disclosure refers to a method for vaccinating a subject to prevent or treat a disease selected from the group consisting of an infection and a cancer, the method comprising administering to the subject the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein or the immunogenic composition as disclosed herein, wherein the nucleic acid is an mRNA encoding an antigen (or a fragment thereof) associated with the disease, and upon administration, the antigen is expressed to elicit an immune response against the disease.

[0107] In another aspect, the present disclosure refers to use of the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein or the immunogenic composition as disclosed herein in the manufacture of a medicament for vaccinating a subject to prevent or treat a disease selected from the group consisting of an infection and a cancer, wherein the medicament is to be administered to the subject, wherein the nucleic acid is an mRNA encoding an antigen (or a fragment thereof) associated with the disease, and upon administration, the antigen is expressed to elicit an immune response against the disease.

[0108] The nucleic acid-lipid nanoparticle or immunogenic composition comprising the nucleic acid-lipid nanoparticle can be used as a vaccine. As used herein, the term "vaccine" refers to an agent such as the functional peptide or protein encoded by the mRNA delivered by the nucleic acid-lipid nanoparticle or immunogenic composition, which may be used to stimulate the immune system of a subject such as a mammal including human. In this way, immune protection against a disease characterized by the functional peptide or protein may be provided against the functional peptide or protein (as an antigen) encoded by the mRNA which is not recognized as a self-antigen by the immune system. In one example, the disease to be vaccinated against is an infection. The infection can be caused by a microbe selected from a bacterium, a virus, an archaea, a protozoa, a fungi, an algae, a slime mode, a lichen, and aprion. Examples of bacterium and virus have been disclosed herein. In one particular example, the infection is caused by an influenza virus and the mRNA in the nanoparticle encode nucleoprotein (NP) of an influenza virus.

[0109] In another example, the disease to be vaccinated against is a cancer. The cancer can be selected from the group consisting of a carcinoma, a sarcoma, a leukaemia, a lymphoma, a myeloma, a brain cancer, and a spinal cord cancer. A carcinoma is a cancer found in body tissue known as epithelial tissue that covers or lines surfaces of organs,  glands, or body structures. For example, a cancer of the lining of the stomach is called a carcinoma. Many carcinomas affect organs or glands that are involved with secretion, such as breasts that produce milk. Types of carcinoma include melanoma, basal cell carcinoma, squamous cell skin cancer and merkel cell carcinoma, etc. A sarcoma is a malignant tumor growing from connective tissues, such as cartilage, fat, muscle, tendons, and bones. The most common sarcoma, a tumor on the bone, usually occurs in young adults. Examples of sarcoma include osteosarcoma (bone) and chondrosarcoma (cartilage) . Types of sarcoma include soft tissue sarcoma, osteosarcoma, Ewing′s sarcoma, chrondrosarcoma, etc. Lymphoma refers to a cancer that originates in the nodes or glands of the lymphatic system, whose job is to produce white blood cells and clean body fluids, or in organs such as the brain and breast. Types of lymphoma include Hodgkin′s lymphoma, Non-Hodgkin′s lymphoma, cutaneous lymphoma, etc. Leukemia, also known as blood cancer, is a cancer of the bone marrow that keeps the marrow from producing normal red and white blood cells and platelets. Examples of leukemia include acute myelogenous leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute lymphocytic leukemia, and chronic lymphocytic leukemia. Myeloma grows in the plasma cells of bone marrow. In some cases, the myeloma cells collect in one bone and form a single tumor, called a plasmacytoma. However, in other cases, the myeloma cells collect in many bones, forming many bone tumors, called multiple myeloma. The most common type of brain tumour develops from glial cells, called glioma. In another example, the cancer can be selected from the group consisting of brain cancer, lung cancer, breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, blood cancer, skin cancer, colorectal cancer, colon cancer, rectal cancer, head and neck cancer, and oral cancer.

[0110] In one example, the mRNA in the nanoparticle as disclosed herein comprises more than one mRNAs, such as 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more mRNAs, each encoding a different antigen associated with an infection or a cancer. In another examples, the more than one mRNAs such as 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more mRNAs are administered in the form of separate formulations, e.g. formulations as multiple separate mRNAs, each of which encode one antigen and is administered separately (e.g. concurrently) . In another example, the more than one mRNAs are administered as a single composition e.g. encapsulated in the same nucleic acid-lipid nanoparticles as disclosed herein.

[0111] The nucleic acid-lipid nanoparticle or the immunogenic composition as disclosed herein which are used as vaccines comprises a safe and effective amount of the at least one  mRNA encoding the antigens as defined above. As used herein, "safe and effective amount" means an amount of the mRNA (and thus of the encoded antigens) that is suitable for stimulating the adaptive immune system in such a manner that no excessive or damaging immune reactions are achieved but, preferably, also no such immune reactions below a measurable level. Such a "safe and effective amount" may furthermore be selected in dependence of the type of mRNA, e.g. monocistronic, bi-or even multicistronic mRNA, since a bi-or even multicistronic mRNA may lead to a significantly higher expression of the encoded antigen (s) than use of an equal amount of a monocistronic RNA. A "safe and effective amount" of the at least one mRNA as defined above will furthermore vary in connection with the particular condition to be treated and also with the age and physical condition of the patient to be treated, the severity of the condition, the duration of the treatment, the nature of the accompanying therapy, of the particular pharmaceutically acceptable carrier used, and similar factors, within the knowledge and experience of the accompanying doctor. The vaccine or immunogenic composition according to the invention can be used according to the invention for human and also for veterinary medical purposes, as a pharmaceutical composition or as a vaccine. In one example, the mRNA in the nucleic acid-lipid nanoparticle to be administered to the subject as a vaccine has a dose of 0.001-5 mg / kg body weight, for example, 0.001-0.1, 0.01-0.5, 0.1-1.0, 0.5-1.5, 1.0-2.0, 1.5-2.5, 2.0-3.0, 2.5-3.5, 3.0-4.0, 3.5-4.5, 4.0-5.0, about 0.001, about 0.01, about 0.02, about 0.05, about 0.1, about 0.2, about 0.5, about 0.8, about 1.0, about 1.5, about 2.0, about 2.5, about 3.0, about 3.5, about 4.0, about 4.5 or about 5.0 mg / kg body weight.

[0112] The nucleic acid-lipid nanoparticle or the immunogenic composition as disclosed herein which are used as vaccines may typically contain a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and / or adjuvant. If the nucleic acid-lipid nanoparticle or the immunogenic composition is provided in liquid form, the carrier will be water, typically pyrogen-free water; isotonic saline or buffered (aqueous) solutions, e.g. phosphate, citrate etc. buffered solutions. Particularly for injection of the nucleic acid-lipid nanoparticle or the immunogenic composition, water or a buffer, or an aqueous buffer, may be used, containing a sodium salt, preferably at least 50 mM of a sodium salt, a calcium salt, preferably at least 0,01 mM of a calcium salt, and optionally a potassium salt, preferably at least 3 mM of a potassium salt. In another example, the sodium, calcium and, optionally, potassium salts may occur in the form of their halogenides, e.g. chlorides, iodides, or bromides, in the form of their hydroxides, carbonates, hydrogen carbonates, or sulfates, etc. Without being limited  thereto, examples of sodium salts include e.g. NaCI, Nal, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, Na2SO4, examples of the optional potassium salts include e.g. KG, Kl, KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4, and examples of calcium salts include e.g. CaCl2, Cal2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca (OH) 2. Furthermore, organic anions of the aforementioned cations may be contained in the buffer. In one example, the buffer suitable for injection purposes as defined above, may contain salts selected from sodium chloride (NaCl) , calcium chloride (CaCl2) and optionally potassium chloride (KCl) , wherein further anions may be present additional to the chlorides. In one example, the salts in the injection buffer are present in a concentration of at least 50 mM sodium chloride (NaCl) , at least 3 mM potassium chloride (KCl) and at least 0001 mM calcium chloride (CaCl2) . The injection buffer may be hypertonic, isotonic or hypotonic with reference to the specific reference medium, i.e. the buffer may have a higher, identical or lower salt content with reference to the specific reference medium, wherein such concentrations of the afore mentioned salts may be used, which do not lead to damage of cells due to osmosis or other concentration effects.

[0113] The choice of a pharmaceutically acceptable carrier is determined in principle by the manner, in which the nucleic acid-lipid nanoparticle or the immunogenic composition is administered. The nucleic acid-lipid nanoparticle or the immunogenic composition can be administered, for example, systemically or locally. Routes for systemic administration in general include, for example, transdermal, oral, parenteral routes, including subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraarterial, intradermal and intraperitoneal injections and / or intranasal administration routes. Routes for local administration in general include, for example, topical administration routes but also intradermal, transdermal, subcutaneous, or intramuscular injections or intralesional, intracranial, intrapulmonal, intracardial, and sublingual injections. In some examples, vaccines may be administered by an intradermal, subcutaneous, or intramuscular route, preferably by injection, which may be needle-free and / or needle injection. In one example the nucleic acid-lipid nanoparticle or the immunogenic composition is administered by jet injection which is one specific form of needle-free injection, wherein a fluid containing the at least one mRNA, the composition or vaccine according to the invention and, optionally, further suitable excipients is forced through an orifice, thus generating an ultra-fine liquid stream of high pressure that is capable of penetrating mammalian skin and, depending on the injection settings, subcutaneous tissue or muscle tissue. In one example, jet injection is used for intradermal, subcutaneous or intramuscular injection of the vaccine according to the invention. In  another example, jet injection is used for intramuscular injection of the vaccine. In another example, jet injection is used for intradermal injection of the vaccine.

[0114] The nucleic acid-lipid nanoparticle or the immunogenic composition can additionally contain one or more auxiliary substances in order to further increase the immunogenicity. A synergistic action of the at least one mRNA of the nucleic acid-lipid nanoparticle or the immunogenic composition and of an auxiliary substance, which may be be co-formulated or separately formulated with the nucleic acid-lipid nanoparticle or the immunogenic composition, is preferably achieved thereby. Depending on the various types of auxiliary substances, various mechanisms can come into consideration in this respect. For example, compounds that permit the maturation of dendritic cells (DCs) , for example lipopolysaccharides, TNF-alpha or CD40 ligand, form a class of suitable auxiliary substances. In general, it is possible to use as auxiliary substance any agent that influences the immune system in the manner of a ″danger signal″ (LPS, GP96, etc. ) or cytokines, such as GM-CFS, which allow an immune response produced by the immune-stimulating adjuvant according to the invention to be enhanced and / or influenced in a targeted manner. Particularly preferred auxiliary substances are cytokines, such as monokines, lymphokines, interleukins or chemokines, that additional to induction of the adaptive immune response by the encoded at least six antigens -promote the innate immune response, such as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31 , IL-32, IL-33, INF-alpha, IFN-beta, INF-gamma, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta or TNF-alpha, growth factors, such as hGH. In one example, such immunogenicity increasing agents or compounds are provided separately (not co-formulated with the vaccine as disclosed herein and administered individually.

[0115] The immunization protocol for the immunization of a subject against the vaccine as defined herein typically comprises a series of single doses or multiple dosages of the nucleic acid-lipid nanoparticle or the immunogenic composition. A single dosage, as used herein, refers to the initial / first dose, and a second dose or any further doses, respectively, are preferably administered in order to ″boost″ the immune reaction. In this context, the interval between the administration of two single dosages can vary from at least one day, for example 2, 3, 4, 5, 6 or 7 days, to at least one week, for example 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 weeks. The intervals between single dosages may be constant or vary over the course of the immunization protocol, e.g. the intervals may be shorter in the beginning and longer  towards the end of the protocol. Depending on the total number of single dosages and the interval between single dosages, the immunization protocol may extend over a period of time, which may lasts at least one week, for example several weeks (e.g. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 weeks) , for example several months (e.g. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 or 24 months) .

[0116] Using the nucleic acid-lipid nanoparticle as disclosed herein or the immunogenic composition as disclosed herein as a vaccine allows modulating, inducing, or enhancing an immune response in a subject as defined above, with a potential to prevent and / or to treat a disease such as an infection or a cancer. In one example, the cancer is selected from the group consisting of locally limited, locally advanced, and metastatic cancer. In one example, the treatment of the disease such as a cancer according to the present invention may be assisted by any approach or any combination approaches known from conventional cancer therapy, such as surgery, radiation therapy, hormonal therapy, occasionally chemotherapy, proton therapy, or any combination thereof, and a therapy using the nucleic acid-lipid nanoparticle as defined herein. In another example, the treatment of the disease such as an infection according to the present invention may be assisted by any approach or any combination approaches known from conventional anti-infection therapy, such as antimicrobials selected from the group consisting of antibacterials, antivirals, antifungals and antiparasitic medications, and a therapy using the nucleic acid-lipid nanoparticle as defined herein.

[0117] As used in this application, the singular form “a, ” “an, ” and “the” include plural references unless the context clearly dictates otherwise. For example, the term “a metal” includes a plurality of metals, including mixtures and combinations thereof.

[0118] As used herein, the term “comprising” means “including. ” Variations of the word ″comprising″ , such as “comprise” and “comprises, ” have correspondingly varied meanings. Thus, for example, a composition “comprising” X may consist exclusively of X or may include one or more additional unrecited components.

[0119] As used herein, the term “about” in the context of concentration of a substance, size of a substance, length of time, or other stated values means + / -5%of the stated value, or + / -4%of the stated value, or + / -3%of the stated value, or + / -2%of the stated value, or + / -1%of the stated value, or + / -0.5%of the stated value.

[0120] Throughout this disclosure, certain embodiments may be disclosed in a range format. It should be understood that the description in range format is merely for  convenience and brevity and should not be construed as an inflexible limitation on the scope of the disclosed ranges. Accordingly, the description of a range should be considered to have specifically disclosed all the possible sub-ranges as well as individual numerical values within that range. For example, description of a range such as from 1 to 6 should be considered to have specifically disclosed sub-ranges such as from 1 to 3, from 1 to 4, from 1 to 5, from 2 to 4, from 2 to 6, from 3 to 6 etc., as well as individual numbers within that range, for example, 1, 2, 3, 4, 5, and 6. This applies regardless of the breadth of the range.

[0121] The disclosure illustratively described herein may suitably be practiced in the absence of any element or elements, limitation or limitations, not specifically disclosed herein. Thus, for example, the terms ″comprising″ , ″including″ , ″containing″ , etc. shall be read expansively and without limitation. Additionally, the terms and expressions employed herein have been used as terms of description and not of limitation, and there is no intention in the use of such terms and expressions of excluding any equivalents of the features shown and described or portions thereof, but it is recognized that various modifications are possible within the scope of the invention claimed. Thus, it should be understood that although the present invention has been specifically disclosed by preferred embodiments and optional features, modification and variation of the inventions embodied herein disclosed may be resorted to by those skilled in the art, and that such modifications and variations are considered to be within the scope of this invention.

[0122] The invention has been described broadly and generically herein. Each of the narrower species and subgeneric groupings falling within the generic disclosure also form part of the invention. This includes the generic description of the invention with a proviso or negative limitation removing any subject matter from the genus, regardless of whether or not the excised material is specifically recited herein.

[0123] Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood to one of ordinary skill in the art to which the invention belongs.

[0124] Other embodiments are within the following claims and non-limiting examples.

[0125] EXAMPLES

[0126] Non-limiting examples of the disclosure will be further described in greater detail by reference to specific Examples, which should not be construed as in any way limiting the scope of the disclosure.

[0127] Example 1-Methodology

[0128] The present invention relates to the use of a compound of ionizable lipid that consists of a central 1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane with substituted alkyl chains (Formula I) or composition comprising Formula I.

[0129] Wherein:

[0130] X is selected from the group consisting of:

[0131] M, W, U and V are each independently selected from the group consisting of.

[0132] n1, n2, n3, n4, n5 and n6 are integers between 1 and 20;

[0133] X is N, O or S;

[0134] D and Q are each independently selected from the group consisting of:

[0135] n1, n2, n3, n4, n5 and n6 are integers between 1 and 20;

[0136] X is N, O or S.

[0137] Synthesis of lipid A1 (with headgroup A and alkyl tail 1 as shown in Figure 1)

[0138] Lipid A1 was synthesized as per the scheme shown in Figure 7A. 1, 4, 7-Triazacyclononane trihydrochloride (238 mg, 1 mmol, 1 eq) , 1-bromobutane (408 mg, 3 mmol, 3 eq) and N, N-Diisopropylethylamine (390 mg, 3 mmol, 3 eq) were dissolved in 20 mL acetonitrile. The reaction mixture was shaken at 60 ℃ and it was completed in 12  hours. Then, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 30: 1 v / v) to get Lipid A1 (216mg, 73%yield) . DCM: Dichloromethane, MeOH: Methanol. Lipids A2-7, A14-15, G1-7 and G14-15 were prepared following a similar method as described for Lipid A1 preparation above.

[0139] Synthesis of lipid A8 (with headgroup A and alkyl tail 8 as shown in Figure 1)

[0140] Lipid A8 was synthesized as per the scheme shown in Figure 7B. 1, 4, 7-Triazacyclononane trihydrochloride (238 mg, 1mmol, 1eq) and 2-butyloxirane (400 mg, 4 mmol, 4 eq) were dissolved in 20 mL isopropanol. The reaction mixture was stirred at 90 ℃and monitored by thin layer chromatography (TLC) . After the reaction was completed, the mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 20: 1 v / v) to get Lipid A8 (274mg, 64%yield) . Lipid A9-13 and G8-13 were prepared following a similar method as described for Lipid A8 preparation above.

[0141] Synthesis of lipid A16 (with headgroup A and alkyl tail 16 as shown in Figure 1)

[0142] Lipid A16 was synthesized as per the scheme shown in Figure 7C. Intermediate 1 was prepared following a similar method to that described for Lipid A8 with a yield of 58%. To a solution of intermediate 1 (597 mg, 1mmol, 1eq) and N, N-Diisopropylethylamine (520 mg, 4 mmol, 4 eq) in DCM (20 mL) was added acryloyl chloride (360 mg, 4 mmol, 4 eq) . The reaction mixture was stirred at room temperature and monitored by TLC. After the reaction was completed, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 40: 1 v / v) to give intermediate 2 (522 mg, 68%yield) . Intermediate 2 (380 mg, 0.5 mmol, 1 eq) , decane-1-thiol (348 mg, 2 mmol, 4 eq) and N, N-Diisopropylethylamine (260 mg, 2 mmol, 4 eq) were dissolved in 20 mL DCM. After the reaction was completed, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 20: 1 v / v) to get Lipid A16 (474 mg, 37%yield) . Lipid A17 and G16-17 were prepared following a similar method as described for Lipid A 16 preparation.

[0143] Synthesis of lipid B1

[0144] Lipid B1 was synthesized as per the scheme shown in Figure 7D. 1, 4, 7-Triazacyclononane trihydrochloride (238 mg, 1mmol, 1eq) , N, N-Diisopropylethylamine (260 mg, 2 mmol, 2 eq) and Di-tert-butyl dicarbonate (436 mg, 2 mmol, 2 eq) were dissolved in 30 mL DCM. The reaction mixture was stirred at room temperature and  monitored by TLC, yielding 207 mg (63 %) of column purified intermediate 3. Intermediate 3 (329 mg, 1 mmol, 1 eq) , 1-bromobutane (180 mg, 1.1 mmol, 1 eq) and N, N-Diisopropylethylamine (195 mg, 1.5 mmol, 1.5 eq) were dissolved in 20 mL acetonitrile. The reaction mixture was shaken at 60 ℃ and it was completed in 12 hours. Then, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 30: 1 v / v) to give intermediate 4 (227mg, 55%yield) . Intermediate 4 (206 mg, 0.5 mmol, 0.5 eq) was deprotected in the mixture of DCM and TFA (9: 1, v: v) and the reaction mixture was concentrated in vacuo. The residue was redissolved in 10 mL acetonitrile, then, 1-bromobutane (135 mg, 1 mmol, 2 eq) and N, N-Diisopropylethylamine (130 mg, 1 mmol, 2eq) were added. The reaction mixture was shaken at 60 ℃ and it was completed in 12 hours. Then, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 30: 1 v / v) to get Lipid B1 (78 mg, 48%yield) . Lipid B2-7, B14-15, C1-7, C14-15, H1-7 and H14-15 were prepared following a similar method as described for Lipid B1 preparation.

[0145] Synthesis of lipid B8

[0146] Lipid B8 was synthesized as per the scheme shown in Figure 7E. Intermediate 4 (410 mg, 1 mmol, 1 eq) was deprotected in the mixture of DCM and TFA (9: 1, v: v) and the reaction mixture was concentrated in vacuo. After the residue was redissolved in 10 mL isopropanol, 2-butyloxirane (200 mg, 2 mmol, 2 eq) was added. The reaction mixture was stirred at 90 ℃ and monitored by TLC. After the reaction was completed, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 20: 1 v / v) to get Lipid B8 (214 mg, 52%yield) . Lipid B9-13, C9-13 and H9-13 were prepared following a similar method as described for Lipid B8 preparation.

[0147] Synthesis of lipid B16

[0148] Lipid B16 was synthesized as per the scheme shown in Figure 7F. Intermediate 5 was prepared following the method as described for Lipid B8 preparation with a yield of 61%. Acryloyl chloride (270 mg, 3 mmol, 3 eq) was added to DCM solution (20 mL) containing intermediate 5 (525 mg, 1mmol, 1eq) and N, N-Diisopropylethylamine (390mg, 3 mmol, 3 eq) . The reaction mixture was stirred at room temperature and monitored by TLC. After the reaction was completed, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 40: 1 v / v) to get  intermediate 6 (430 mg, 68 %yield) . Intermediate 6 (315 mg, 0.5 mmol, 1 eq) , decane-1-thiol (348 mg, 2 mmol, 4 eq) and N, N-Diisopropylethylamine (260 mg, 2 mmol, 4 eq) were dissolved in 20 mL DCM. After the reaction was completed, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 20: 1 v / v) to get lipid A16 (291mg, 60 %yield) . Lipid B17, C16-17 and H16-17 were prepared following a similar method as described for Lipid B16 preparation.

[0149] Synthesis of lipid D1

[0150] Lipid D1 was synthesized as per the scheme shown in Figure 7G. Intermediate 3 (329 mg, 1 mmol, 1 eq) , tert-butyl (3-bromopropyl) carbamate (237 mg, 1 mmol, 1 eq) and N, N-Diisopropylethylamine (190 mg, 1.5 mmol, 1.5 eq) were dissolved in 20 mL acetonitrile. The reaction mixture was shaken at 60 ℃ for 12 hours and concentrated in vacuo. Then, the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 40: 1 v / v) to give intermediate 5 (369 mg, 76%yield) . Intermediate 5 (243 mg, 0.5 mmol, 1 eq) was deprotected in the mixture of DCM and TFA (9: 1, v: v) and the reaction mixture was concentrated in vacuo. After the residue was redissolved in 10 mL acetonitrile, 1-bromobutane (272 mg, 2 mmol, 4 eq) and N, N-Diisopropylethylamine (390 mg, 3 mmol, 6 eq) were added. The reaction mixture was shaken at 60 ℃ and it was completed in 12 hours. Then, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 20: 1 v / v) to get Lipid D1 (119 mg, 58%yield) . Lipid D2-7 and D14-15 were prepared following a similar method as described for Lipid D1 preparation.

[0151] Synthesis of lipid D8

[0152] Lipid D8 was synthesized as per the scheme shown in Figure 7H. Intermediate 5 (243 mg, 0.5 mmol, 1 eq) was deprotected in the mixture of DCM and TFA (9: 1, v: v) and the reaction mixture was concentrated in vacuo. After the residue was redissolved in 10 mL isopropanol, 2-butyloxirane (200 mg, 2 mmol, 4 eq) was added. The reaction mixture was stirred at 90 ℃ and monitored by TLC. After the reaction was completed, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 15: 1 v / v) to get Lipid D8 (129 mg, 44 %yield) . Lipid D9-13 were prepared following a similar method as described for Lipid D8 preparation.

[0153] Synthesis of lipid D16

[0154] Lipid D16 was synthesized as per the scheme shown in Figure 7I. Intermediate 8 was prepared following a similar method to that described for Lipid D8 with a yield of 51%.  To a solution of intermediate 8 (796 mg, 1mmol, 1eq) and N, N-Diisopropylethylamine (780 mg, 6 mmol, 6 eq) in DCM (20 mL) was added acryloyl chloride (540 mg, 6 mmol, 6 eq) . The reaction mixture was stirred at room temperature and monitored by TLC. After the reaction was completed, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 20: 1 v / v) to get intermediate 9 (627 mg, 62 %yield) . Intermediate 9 (500 mg, 0.5 mmol, 1 eq) , decane-1-thiol (522 mg, 3 mmol, 6 eq) and N, N-Diisopropylethylamine (390 mg, 3 mmol, 6 eq) were dissolved in 20 mL DCM. After the reaction was completed, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 20: 1 v / v) to get lipid D16 (376 mg, 44 %yield) . Lipid D17 was prepared following a similar method as described for Lipid D 16 preparation.

[0155] Synthesis of lipid E1

[0156] Lipid E1 was synthesized as per the scheme shown in Figure 7J and as follows. Intermediate 10 was prepared following a similar method to that described for intermediate 7 with a yield of 67%. Intermediate 7 (263 mg, 0.5 mmol, 1 eq) was deprotected in the mixture of DCM and TFA (9: 1, v: v) and the reaction mixture was concentrated in vacuo. After the residue was redissolved in 10 mL acetonitrile, 1-bromobutane (408 mg, 3 mmol, 6 eq) and N, N-Diisopropylethylamine (520 mg, 4 mmol, 8 eq) were added. The reaction mixture was shaken at 60 ℃ for 12 hours. Then, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 20: 1 v / v) to give Lipid E1 (107 mg, 41%yield) . Lipid E2-7, E14-15, F1-7 and F14-15 were prepared following a similar method to that described for Lipid E1 preparation.

[0157] Synthesis of lipid E8

[0158] Lipid E8 was synthesized as per the scheme shown in Figure 7K. Intermediate 10 (263 mg, 0.5 mmol, 1 eq) was deprotected in the mixture of DCM and TFA (9: 1, v: v) and the reaction mixture was concentrated in vacuo. After the residue was redissolved in 10 mL isopropanol, 2-butyloxirane (300 mg, 3 mmol, 6 eq) was added. The reaction mixture was stirred at 90 ℃ and monitored by TLC. After the reaction was completed, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 10: 1 v / v) to get Lipid D8 (138 mg, 38 %yield) . Lipid E9-13 and F8-13 were prepared following a similar method as described for Lipid E8 preparation.

[0159] Synthesis of lipid E16

[0160] Lipid E16 was synthesized as per the scheme shown in Figure 7L. Intermediate 11 was prepared following a similar method for Lipid E8 preparation with a production yield of 37%. Then acryloyl chloride (540 mg, 6 mmol, 6 eq) was added to DCM solution (20 mL) containing intermediate 11 (951 mg, 1mmol, 1eq) and N, N-Diisopropylethylamine (780 mg, 6 mmol, 6 eq) . The reaction mixture was stirred at room temperature and monitored by TLC. After the reaction was completed, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 15: 1 v / v) to get intermediate 12 (665 mg, 57 %yield) . Intermediate 9 (583 mg, 0.5 mmol, 1 eq) , decane-1-thiol (522 mg, 3 mmol, 6 eq) and N, N-Diisopropylethylamine (390 mg, 3 mmol, 6 eq) were dissolved in 20 mL DCM. After the reaction was completed, the reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 15: 1 v / v) to get lipid E16 (312 mg, 33 %yield) . Lipid E17 and F16-17 were prepared following a similar method as described for Lipid E 16 preparation.

[0161] LNP formulation method

[0162] LNPs were formulated by mixing ethanol phase containing lipids with mRNA molecules in aqueous phase at a volume ratio of 3: 1 (aqueous: ethanol phase) following vortex for 5 min. Briefly, ethanol phase was prepared with mixture of lipids including synthesized ionizable lipid, distearoylphosphatidylcholine (DSPC) , cholesterol and 1, 2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2000) at the molar ratio of 50: 10: 38.5: 1.5. The aqueous phase was prepared in 10 mM citrate buffer (pH 4.0) with luciferase mRNA, EGFP mRNA, influenza nucleoprotein (NP) mRNA. The above solution was dialyzed against PBS (1×) for at least 12 h to remove the acidic buffer and ethanol. After the dialysis, the solution was transferred to an RNase-free tube for follow-up experiments.

[0163] In vitro and in vivo mRNA uptake and transfection efficiency assay

[0164] In vitro study: LNPs were prepared accordingly to load luciferase mRNA (Luc-LNP) . HEK 293T cells, pulmonary epithelial cell line (A549) and murine dendric cell line (DC2.4) were treated with Luc-LNPs and classic DLin-MC3-DMA based LNP formulation with molar ratio of 50: 10: 38.5: 1.5 (DLin-MC3-DMA: DSPC: cholesterol: DMG-PEG2000) . Luciferase expression was measured after overnight incubation with Renilla-Glo Luciferase Assay System.

[0165] In vivo study: For in vivo luciferase expression assays, 6-8 weeks female Balb / c mice were intramuscularly injected with luciferase mRNA loaded LNPs (2 μg mRNA / mouse) with the same formulation ratios as stated above. After 6 h, the transfection efficiency of delivered luciferase mRNA loaded LNP was quantified using luminescence signal at the injection site via IVIS imaging system (Perkin Elmer) to identify the outstanding ionizable lipids in mRNA delivery.

[0166] Immunization study of influenza mRNA vaccine

[0167] Influenza mRNA vaccines were loaded into the LNP nanoparticles to evaluate immunization effect. In brief, 4-6 weeks female Balb / c mice were vaccinated with NP mRNA (1-10 μg / mouse) on day 0 and day 21. Peripheral blood were collected on day 28 for T cell immune response analysis. T cells were sorted followed by stimulation with antigen peptides pool. Cytokines production by CD4+ and CD8+ T cells were analyzed by flow cytometry. In addition, antibody response in serum on day 18 and day 28 after immunization was evaluated via ELISA assay.

[0168] Example 2-Results

[0169] The new ionizable lipids are classified by 8 different 1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane heads (A-H) as shown in Figure 1, and each headgroup contains 17 different alkyl tails (1 -17) .

[0170] LNPs comprising the new ionizable lipid, distearoylphosphatidylcholine (DSPC) , cholesterol and 1, 2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2000) were prepared with the molar ratio of 50: 10: 38.5: 1.5 to load Renilla luciferase encoded mRNA. HEK 293T cells, pulmonary epithelial cell line (A549) and murine dendric cell line (DC2.4) were treated with Luc-LNPs and classic DLin-MC3-DMA based LNP formulation (control) with molar ratio of 50: 10: 38.5: 1.5 (DLin-MC3-DMA: DSPC: cholesterol: DMG-PEG2000) and luciferase expression was measured after overnight incubation with Renilla-Glo Luciferase Assay System (Figure 2) , showing the superiority of LNPs containing the new ionizable lipids in mRNA delivery. Tables 1-3 showed the fold expression change for the designed LNPs across the 3 different cell lines. As can be seen, LNPs containing the new ionizable lipids of the present invention performed the best in mRNA delivery to the three types of cell lines.

[0171] Table 1. Fold expression change for the designed LNPs in HEK293T

[0172] Table 2. Fold expression change for the designed LNPs in A549

[0173] Table 3. Fold expression change for the designed LNPs in DC2.4

[0174] Then, the top-performing new ionizable lipids based LNPs screened in Figure 2 were tested in vivo. 6-8 weeks female Balb / c mice were intramuscularly injected with Luc-LNPs (2 μg mRNA / mouse) with the same formulation ratios as stated above. After 6 h, the transfection efficiency of delivered Luc LNP was quantified using luminescence signal at the injection site via IVIS imaging system (Figure 3) , identifying the outstanding ionizable lipids in mRNA delivery.

[0175] Nucleoprotein (NP) encoded mRNA were loaded into the top-performing LNP nanoparticles (H17) and screened in vivo as shown in Figure 4 to evaluate immunization and protection effect against influenza virus. 4-6 weeks female Balb / c mice were vaccinated with 1 or 10 μg NP mRNA on day 0 and day 14. Peripheral blood were collected on day 21 for T cell immune response analysis. T cells were sorted followed by stimulation with NP peptides. Cytokines production by CD4+ and CD8+ T cells were analyzed by flow cytometry, showing that NP mRNA-LNP vaccine can effectively induce the production of IFNγ. In addition, the NP antibody concentration in serum was tested on day 10 and day 21 after immunization via ELISA assay, showing that higher immunization dose and boosting injection of mRNA vaccines would induce stronger antibody response.

[0176] To investigate the in vivo systemic mRNA delivery tendency of these LNPs, Firefly luciferase encoding mRNA (fLuc mRNA) was encapsulated within the LNPs developed herein and the in vivo expression of luciferase protein was visualized using IVIS imaging system. Interestingly, it was found that the bioluminescence signals of LNPs  composed of ionizable lipid with E-and F-series head were mainly located in the spleen and lung. Specifically, LNPs composed of E9 showed specific delivery tendency to spleen (＞90%LNPs were accumulated in the spleen tissues) (Figure 5, Table 4) , and F11 showed delivery tendency to lung (＞90%LNPs were accumulated in the lung tissues) (Figure 6, Table 5) .

[0177] Table 4. In vivo delivery efficacy of Fluc mRNA loaded by E-series LNPs measured by the IVIS imaging system. Mice were injected with Fluc mRNA-loaded E-series LNPs at a single dose of 0.5 mg / kg. Images were taken at 6 h postinjection (n = 3) .

[0178] Table 5. In vivo delivery efficacy of Fluc mRNA loaded by F-series LNPs measured by the IVIS imaging system. Mice were injected with Fluc mRNA-loaded E-series LNPs at a single dose of 0.5 mg / kg. Images were taken at 6 h postinjection (n = 3) .

[0179] Example 3-Discussion

[0180] The preliminary data has verified that the novel ionizable lipids and lipid nanoparticles comprising the novel ionizable lipids outperform the current commercial lipid nanoparticle formulations (e.g. DLin-MC3-DMA, SM102) in mRNA delivery and protein expression. The cationic lipids based lipidoids or liposomes presented in the current literature are less effective in mRNA delivery compared to those of the present invention.Industrial Applicability

[0181] It will be apparent that various other modifications and adaptations of the invention will be apparent to the person skilled in the art after reading the foregoing disclosure without departing from the spirit and scope of the invention and it is intended that all such modifications and adaptations come within the scope of the appended claims.

Claims

1.An ionizable lipid comprising alkyl substituted 1, 4, 7-triazacyclononane or 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane, the ionizable lipid having the structure of Formula I: wherein:X is selected from the group consisting of:M, W, U and V are each independently selected from the group consisting of:D and Q are each selected from the group consisting of:n1, n2, n3, n4, n5 and n6 are integers between 1 and 20; andX is N, O or S.2.The ionizable lipid of claim 1, comprising a structure of Formula II: 3.A lipid nanoparticle for delivering a nucleic acid, comprising the ionizable lipid of claim 1.4.The lipid nanoparticle of claim 3, further comprising a non-ionizable lipid selected from the group consisting of a phospholipid and cholesterol, and a PEG-conjugated lipid.5.The lipid nanoparticle of claim 4, wherein the phospholipid is selected from the group consisting of distearoylphosphatidylcholine (1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) , 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) , 1-hexadecanoyl-2-- (9Z-octadecenoyl) -sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) , and 1, 2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DHPC) .6.The lipid nanoparticle of claim 4, wherein the PEG-conjugated lipid is selected from the group consisting of 1, 2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2000) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) -2000] (DSPE-PEG2000) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine-PEG2K (DSPC-PEG2000) , distearoyl-rac-glycerol-PEG2K (DSG-PEG 2000) and N-palmitoyl-sphingosine-1- {succinyl [methoxy (polyethylene glycol) 2000] (C16 PEG2000) .7.The lipid nanoparticle of claim 3 or 4, wherein the ionizable lipid of claim 1 comprises from 5 mol %to 70 mol %of the total lipid present in the nanoparticle.8.The lipid nanoparticle of claim 4, wherein the non-ionizable lipid comprises from 10 mol%to 90 mol %of the total lipid present in the nanoparticle.9.The lipid nanoparticle of claim 8, wherein the phospholipid comprises from 5 mol %to 70 mol %of the total lipid present in the nanoparticle, and the cholesterol comprises from 5 mol %to 70 mol %of the total lipid present in the nanoparticle.10.The lipid nanoparticle of claim 4, wherein the PEG-conjugated lipid comprises from 1 mol%to 10 mol %of the total lipid present in the nanoparticle.11.The lipid nanoparticle of claim 4, wherein the phospholipid is DSPC, the PEG-conjugated lipid is DMG-PEG2000, and the molar ratio of the ionizable lipid of claim 1, DSPC, cholesterol and DMG-PEG2000 is 50: 10: 38.5: 1.5.12.The lipid nanoparticle of claim 3, wherein the nucleic acid comprises a messenger RNA (mRNA) .13.A nucleic acid-lipid nanoparticle comprising: (a) a nucleic acid; and (b) the lipid nanoparticle of any one of claims 3-12.14.The nucleic acid-lipid nanoparticle of claim 13, wherein the nucleic acid comprises a messenger RNA (mRNA) .15.The nucleic acid-lipid nanoparticle of claim 13, wherein the nucleic acid is fully encapsulated in the nucleic acid-lipid nanoparticle.16.The nucleic acid-lipid nanoparticle of claim 13, wherein the nucleic acid-lipid nanoparticle has a lipid: nucleic acid mass ratio of from 1: 100 to 200: 1.17.The nucleic acid-lipid nanoparticle of any one of claims 13-16, wherein the nucleic acid-lipid nanoparticle has a median diameter of from 40 nm to 300 nm.18.The nucleic acid-lipid nanoparticle of any one of claims 13-17, wherein the nucleic acid-lipid nanoparticle comprises a polydispersity index (PDI) from 0.1 to 0.3.19.A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid-lipid nanoparticle of any one of claims 13-18 and a pharmaceutically acceptable carrier.20.An immunogenic composition comprising the nucleic acid-lipid nanoparticle of any one of claims 13-18 and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and / or adjuvant.21.The immunogenic composition of claim 20, wherein the nucleic acid is an mRNA encoding an antigen (or a fragment thereof) associated with an infection or a cancer.22.The immunogenic composition of claim 21, wherein the antigen is nucleoprotein (NP) of an influenza virus.23.The pharmaceutical composition of claim 19 or the immunogenic composition of any one of claims 20-22, wherein the composition is lyophilized, or a reconstituted lyophilized composition.24.An in vitro method for introducing a nucleic acid into a cell, the method comprising contacting the cell with the nucleic acid-lipid nanoparticle of any one of claims 13-18.25.A method for the in vivo delivery of a nucleic acid, the method comprising administering to a subject a nucleic acid-lipid nanoparticle of any one of claims 13-18.26.The method of claim 25, wherein the administration is selected from the group consisting of oral, intranasal, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intra-articular, intralesional, intratracheal, subcutaneous, and intradermal administration.27.The method of claim 26, wherein the administration is intramuscular administration.28.The method of claim 25, wherein the subject is human.29.A method of treating a subject having a disease caused by deficiency in a functional peptide or protein, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the nucleic acid-lipid nanoparticle of any one of claims 13-18 or the pharmaceutical composition of claim 19 or 23, wherein the nucleic acid is a mRNA encoding the functional peptide or protein, wherein following administration the functional peptide or protein is expressed in a target cell.30.Use of the nucleic acid-lipid nanoparticle of any one of claims 13-18 or the pharmaceutical composition of claim 19 or 23 in the manufacture of a medicament for treating a subject having a disease caused by deficiency in a functional peptide or protein, wherein the nucleic acid is a mRNA encoding the functional peptide or protein, wherein following administration the functional peptide or protein is expressed in a target cell.31.The method of claim 29 or use of claim 30, wherein the target cell is selected from the group consisting of an epithelial cell, a hematopoietic cell, epithelial cells, an endothelial cell, a lung cell, a hepatocyte, a bone cell, a stem cell, a mesenchymal cell, a neural cell, a cardiac cell, a cardiomyocyte, an adipocyte, a vascular smooth muscle cell, a skeletal muscle cell, a beta cell, a pituitary cell, a synovial lining cell, an ovarian cell, a testicular cell, a fibroblast, a B cell, a T cell, a dendritic cell, a reticulocyte, a leukocyte, a granulocyte and a tumor cell.32.The method or the use of claim 31, wherein the subject is human.33.The method or the use of claim 32, wherein the functional peptide or protein is expressed for a period of 1-7 days.34.The method of any one of claims 29 and 31-33, or the use of any one of claim 30-33, wherein the disease is selected from the groups consisting of an infection and a cancer.35.A method for vaccinating a subject to prevent or treat a disease selected from the group consisting of an infection and a cancer, the method comprising administering to the subject the nucleic acid-lipid nanoparticle of any one of claims 13-18 or the immunogenic composition of any one of claims 20-23, wherein the nucleic acid is an mRNA encoding an antigen (or a fragment thereof) associated with the disease, and upon administration, the antigen is expressed to elicit an immune response against the disease.36.Use of the nucleic acid-lipid nanoparticle of any one of claims 13-18 or the immunogenic composition of any one of claims 20-23 in the manufacture ofa medicament for vaccinating a subject to prevent or treat a disease selected from the group consisting of an infection and a cancer, wherein the medicament is to be administered to the subject, wherein the nucleic acid is an mRNA encoding an antigen (or a fragment thereof) associated with the disease, and upon administration, the antigen is expressed to elicit an immune response against the disease.37.The method of claim 35 or the use of claim 36, wherein the infection is caused by a virus selected from the group consisting of an influenza virus (including an influenza A or influenza B) , a coronavirus such as SARS-CoV-2, an Ebola virus, measles, SARS, Chikungunya virus, Marburg, MERS, Dengue, Lassa, rhabdovirus, HIV, a hepatitis virus (including hepatitis A, B, C, D, or E) , a human respiratory syncytial virus, Sudan ebola virus, Bundibugyo virus, Tai Forest ebola virus, Reston ebola virus, Achimota virus, Aedes flavivirus, Aguacate virus, Akabane virus, Alethinophid reptarenavirus, Allpahuayo mammarenavirus, Amapari mmarenavirus, Andes virus, Apoi virus, Aravan virus, Aroa virus, Arumwot virus, Atlantic salmon paramyxovirus, Australian bat lyssavirus, Avian bomavirus, Avian metapneumovirus, Avian paramyxoviruses, penguin or Falkland Islandsvirus, BK polyomavirus, Bagaza virus, Banna virus, Bat herpesvirus, Bat sapovirus, Bear Canon mammarenavirus, Beilong virus, Betacoronavirus, Betapapillomavirus 1-6, Bhanja virus, Bokeloh bat lyssavirus, Boma disease virus, Bourbon virus, Bovine hepacivirus, Bovine parainfluenza virus 3, Bovine respiratory syncytial virus, Brazoran virus, Bunyamwera virus, Caliciviridae virus. California encephalitis virus, Candiru virus, Canine distemper virus, Canine pneumovirus, Cedar virus, Cell fusing agent virus, Cetacean morbillivirus, Chandipura virus, Chaoyang virus, Chapare mammarenavirus, Colobus monkey papillomavirus, Colorado tick fever virus, Cowpox virus, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Culex flavivirus, Cupixi mammarenavirus, Dengue virus,  Dobrava-Belgrade virus, Donggang virus, Dugbe virus, Duvenhage virus, Eastern equine encephalitis virus, Entebbe bat virus, Enterovirus A-D, European bat lyssavirus 1-2, Eyach virus, Feline morbillivirus, Fer-de-Lance paramyxovirus, Fitzroy River virus, Flaviviridae virus, Flexal mammarenavirus, GB virus C, Gairo virus, Gemycircularvirus, Goose paramyxovirus SF02, Great Island virus, Guanarito mammarenavirus, Hantaan virus, Hantavirus Z10, Heartland virus, Hendra virus, Hepatitis A / B / C / E, Hepatitis delta virus, Human bocavirus, Human coronavirus, Human endogenous retrovirus K, Human enteric coronavirus, Human genital-associated circular DNA virus-1, Human herpesvirus 1-8, Human mastadenovirus A-G, Human papillomavirus, Human parainfluenza virus 1-4, Human paraechovirus, Human picomavirus, Human smacovirus, Ikoma lyssavirus, Ilheus virus, Influenza A-C, Ippy mammarenavirus, Irkut virus, J-virus, JC polyomavirus, Japanese encephalitis virus, Junin mammarenavirus, KI polyomavirus, Kadipiro virus, Kamiti River virus, Kedougou virus, Khujand virus, Kokobera virus, Kyasanur forest disease virus, Lagos bat virus, Langat virus, Lassa mammarenavirus, Latino mammarenavirus, Leopards Hill virus, Liao ning virus, Ljungan virus, Lloviu virus, Louping ill virus, Lujo mammarenavirus, Luna mammarenavirus, Lunk virus, Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus, Lyssavirus Ozemoe, MSSI2Y225 virus, Machupo mammarenavirus, Mamastrovirus 1, Manzanilla virus, Mapuera virus, Marburg virus, Mayaro virus, Measles virus, Menangle virus, Mercadeo virus, Merkel cell polyomavirus, Middle East respiratory syndrome coronavirus, Mobala mammarenavirus, Modoc virus, Moijang virus, Mokolo virus, Monkeypox virus, Montana myotis leukoenchalitis virus, Mopeia lassa virus reassortant 29, Mopeia mammarenavirus, Morogoro virus, Mossman virus, Mumps virus, Murine pneumonia virus, Murray Valley encephalitis virus, Nariva virus, Newcastle disease virus, Nipah virus, Norwalk virus, Norway rat hepacivirus, Ntaya virus, O′nyong-nyong virus, Oliveros mammarenavirus, Omsk hemorrhagic fever virus, Oropouche virus, Parainfluenza virus 5, Parana mammarenavirus, Parramatta River virus, Peste-des-petits-ruminants virus, Pichande mammarenavirus, Picomaviridae virus, Pirital mammarenavirus, Piscihepevirus A, Porcine parainfluenza virus 1, porcine rubulavirus, Powassan virus, Primate T-lymphotropic virus 1-2, Primate erythroparvovirus 1, Punta Toro virus, Puumala virus, Quang Birth virus, Rabies virus, Razdan virus, Reptile bomavirus 1, Rhinovirus A-B, Rift Valley fever virus, Rinderpest virus, Rio Bravo virus, Rodent Torque Teno virus, Rodent hepacivirus, Ross River virus, Rotavirus A-I, Royal Farm virus, Rubella virus, Sabia mammarenavirus, Salem virus, Sandfly fever Naples virus, Sandfly fever Sicilian virus, Sapporo virus, Sathuperi  virus, Seal anellovirus, Semliki Forest virus, Sendai virus, Seoul virus, Sepik virus, Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus, Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, Shamonda virus, Shimoni bat virus, Shuni virus, Simbu virus, Simian torque teno virus, Simian virus 40-41, Sin Nombre virus, Sindbis virus, Small anellovirus, Sosuga virus, Spanish goat encephalitis virus, Spondweni virus, St. Louis encephalitis virus, Sunshine virus, TTV-like mini virus, Tacaribe mammarenavirus, Taila virus, Tamana bat virus, Tamiami mammarenavirus, Tembusu virus, Thogoto virus, Thottapalayam virus, Tick-borne encephalitis virus, Tioman virus, Togaviridae virus, Torque teno canis virus, Torque teno douroucouli virus, Torque teno felis virus, Torque teno midi virus, Torque teno sus virus, Torque teno tamarin virus, Torque teno virus, Torque teno zalophus virus, Tuhoko virus, Tula virus, Tupaia paramyxovirus, Usutu virus, Uukuniemi virus, Vaccinia virus, Variola virus, Venezuelan Vesicular stomatitis Indiana virus, WU Polyomavirus, Wesselsbron virus, West Caucasian bat virus, West Nile virus, Western equine encephalitis virus, Whitewater Arroyo mammarenavirus, Yellow fever virus, Yokose virus, Yug Bogdanovac virus, Zaire ebolavirus, Zika virus, or Zygosaccharomyces bailii virus Z viral sequence, Canine Parvovirus, Canine Distemper Virus, Canine Coronavirus, Canine Influenza Virus, Feline Herpesvirus, Feline Calicivirus, Feline Leukemia Virus, Feline Immunodeficiency Virus, Canine Adenovirus -Type 1 and Type 2, Canine Herpesvirus, Tobacco Mosaic Virus, Potato Virus Y, Tomato Spotted Wilt Virus, Cucumber Mosaic Virus, Potato Virus X, Barley Yellow Dwarf Virus, Bean Common Mosaic Virus, Maize Dwarf Mosaic Virus, Soybean Mosaic Virus, Citrus Tristeza Virus, Rice Yellow Mottle Virus, Plum Pox Virus, Turnip Mosaic Virus, Aphid-Transmitted Yellow Dwarf Viruses, Cotton Leaf Curl Virus, Papaya Ringspot Virus, Cassava Mosaic Virus, Rice Tungro Virus, Apple Mosaic Virus, Sugarcane Mosaic Virus or a combination thereof.38.The method of claim 35 or the use of claim 36, wherein the antigen is nucleoprotein (NP) of an influenza virus.39.The method of claim 35 or the use of claim 36, wherein the cancer is selected from the group consisting of a carcinoma, a sarcoma, a leukaemia, a lymphoma, a myeloma, a brain cancer, and a spinal cord cancer.40.The method of claim 29 or 35, or the use of claim 30 or 36, wherein the subject is to be administered with a co-therapy selected from the group consisting of an anticancer therapy, and an antimicrobial treatment.41.The method of claim 29 or 35, or the use of claim 30 or 36, wherein the nucleic acid-lipid nanoparticle is delivered specifically to lung or spleen after administration to the subject.

Images