Novel camptothecin derivative and conjugate thereof, preparation method therefor and application thereof

Abstract

Provided is a novel camptothecin derivative or a conjugate thereof, and a preparation method therefor and an application thereof in medicine. Specifically, provided is a compound represented by general formula (A) or a ligand-drug conjugate thereof, a preparation method therefor, and an application of the ligand-drug conjugate and a pharmaceutical composition thereof in the preparation of a drug for the treatment of cancer or immunological diseases.

Description

NOVEL CAMPTOTHECIN DERIVATIVE AND CONJUGATE THEREOF, PREPARATION METHOD THEREFOR AND APPLICATION THEREOFFIELD OF THE INVENTION

[0001] The invention generally relates to novel compounds and therapeutic uses thereof. More particularly, the invention provides novel camptothecin derivatives and conjugates thereof, as well as pharmaceutical compositions and methods of preparation and use for treating various diseases and disorders (e.g. cancer) .BACKGROUND ART

[0002] Ligand-mediated targeted therapy plays an increasingly important role in the treatment of various disorders, such as cancers and immunological diseases. Ligand-drug conjugates (LDCs) , sepecially antibody-drug conjugates (ADCs) thereof as an emerging concept in cancer therapy has been shown to improve the efficacy and therapeutic window. Topoisomerases (I and II) play critical roles in DNA replication, transcription, and chromosome structure by relaxing supercoiled DNA and decatenating interlocked DNA, which are essential for cell survival and intimately associated with cancer emergence and metastatic progression. Topoisomerase I inhibitors are cytotoxic chemotherapeutic derivatives with a camptothecin (CPT) core, which can be used for oncologic therapies by blocking the function of topoisomerase I. Various topoisomerase I inhibitors such as irinotecan, exatecan and belotecan derivatives have been developed into ADCs testing in clinical trials or being approved by FDA. For example, Her2-targeted DS-8201a (Enhertu, Tratuzumab deruxtecan, Daiichi Sankyo) with DXd as a payload was approved for any Her2-positive solid cancer and Trop2-targeted IMMU-132 (Trodelvy, sacituzumab govitecan, Gilead) with SN-38 as a payload was approved for adults with HR+ / Her2-metastatic breast cancer. Despite active development, challenges still exist, for example, poor water solubility of payload, toxicity due to the ligand binding to its target in normal tissue, and dispersion of the cytotoxic payload in normal tissue due to instability of the linker of ligand-drug conjugate etc.. Thus, there remains a great need to further develop CPT derivatives and corresponding ligand-drug conjugates that may have properties such as physical properties, pharmacokinetic profiles, payload release profiles, biological activity profiles, or safety profiles, which differ from those of known CPT derivatives and LDCs.SUMMARY OF THE INVENTION

[0003] The present disclosure relates to a linker with a specific structure and an active compound with a specific structure, and a ligand-drug conjugates composed of a linker, an active compound and an antibody. The ligand-drug conjugates are degraded in the body to release active molecules, thereby showing an anti-tumor effect.

[0004] The present invention, in one aspect, provides a compound of formula (E) :

[0005] or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof, wherein,

[0006] R1, R2 are each independently selected from the group consisting of (i) absent, hydrogen, deuterium, alkyl, deuteryl alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, amino-carbonyl, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio,   (ii) cycloalkyl, alkyl-cycloalkyl, heterocyclyl, alkyl-heterocyclyl, aryl, alkyl-aryl, heteroaryl, alkyl-heterocyclyl, R1 and R2 are each independently optionally substituted with 1, 2, 3, 4, or 5 of R1a

[0007] or R1 and R2 together with the atoms to which they are attached form a structure selected from the group consisting of cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, the heterocyclyl and heteroaryl are each independently containing heteroatoms selected from N, O or S, the cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl are each optionally substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R1a;

[0008] or R1 and R14 together with the atoms to which they are attached form a structure selected from the group consisting of cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, the heterocyclyl and heteroaryl are each independently containing heteroatoms selected from N, O or S, the cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl are each optionally substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R1a; R12 and R13 are each independently selected from the group consisting of hydrogen,

[0009] R3 and R10 are each independently selected from the group consisting of (i) absent, hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio, (ii) cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, R3 is optionally substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R3a, R10 is optionally substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R10a;

[0010] R4, R11 and R12a are each independently selected from the group consisting of hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, amino, cyano, hydroxyl, halogen;

[0011] R1a, R3a, R10a and R15a are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio, azide, sulfonyl, amino-carbonyl (ii) cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, -alkyl-heterocyclyl, R1a, R3a, R10a and R15a are each independently optionally substitute with 1, 2, 3, 4 or 5 of R7, heterocyclyl and heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q;

[0012] R7 , R5 and R6 are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio, azide, -alkyl-azide (ii) cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, -alkyl-cycloalkyl, -alkyl-heterocyclyl, -alkyl-aryl, -alkyl-heteroaryl;

[0013] m is 0, 1, 2, 3 or 4;

[0014] q is 0, 1 or 2;

[0015] L is 0, 1 or 2.

[0016] The present invention, in one aspect, provides a compound of formula (A) , formula (B) , formula (C) formula (D) :

[0017] or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof, wherein,

[0018] R1, R2 are each independently selected from the group consisting of (i) absent, hydrogen, deuterium, alkyl, deuteryl alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, amino-carbonyl, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio,   (ii) cycloalkyl, alkyl-cycloalkyl, heterocyclyl, alkyl-heterocyclyl, aryl, alkyl-aryl, heteroaryl, alkyl-heterocyclyl, R1 and R2 are each independently optionally substituted with 1, 2, 3, 4, or 5 of R1a

[0019] or R1 and R2 together with the atoms to which they are attached form a structure selected from the group consisting of cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, the heterocyclyl and heteroaryl are each independently containing heteroatoms selected from N, O or S, the cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl are each optionally substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R1a;

[0020] or R1 and R14 together with the atoms to which they are attached form a structure selected from the group consisting of cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, the heterocyclyl and heteroaryl are each independently containing heteroatoms selected from N, O or S, the cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl are each optionally substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R1a; R12 and R13 are each independently selected from the group consisting of hydrogen,

[0021] R3 and R10 are each independently selected from the group consisting of (i) absent, hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio, (ii) cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, R3 is optionally substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R3a, R10 is optionally substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R10a;

[0022] R4 and R11 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, amino, cyano, hydroxyl, halogen;

[0023] R1a, R3a, R10a and R15a are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio, azide, sulfonyl, amino-carbonyl (ii) cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, -alkyl-heterocyclyl, R1a, R3a, R10a and R15a are each independently optionally substitute with 1, 2, 3, 4 or 5 of R7, heterocyclyl and heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q;

[0024] R7 , R5 and R6 are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio, azide, -alkyl-azide (ii) cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, -alkyl-cycloalkyl, -alkyl-heterocyclyl, -alkyl-aryl, -alkyl-heteroaryl;

[0025] R14 and R15 are each independently selected from the group consisting of (i) absent, hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio, azide, (ii) cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, -alkyl-cycloalkyl, -alkyl-heterocyclyl, -alkyl-aryl, -alkyl-heteroaryl; or R14 and R15 together with two adjacent atoms to which they are attached form a cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl and heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q; R14 and R15 or the cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl formed by R14 and R15 are each independently substituted with 1, 2, 3 or 4 of R15a;

[0026] R16 and R17 are each independently selected from the group consisting of (i) absent, hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio, azide, OXO (ii) cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, -alkyl-cycloalkyl, -alkyl-heterocyclyl, -alkyl-aryl, -alkyl-heteroaryl; or R16 and R17 together with the adjacent atom to which they are attached form a cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl and heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q; R16 and R17 or the cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl formed by R16 and R17 are each independently substituted with 1, 2, 3 or 4 of R15a;

[0027] X1, X2, X3, X4, X5 are each independently selected from the group consisting of CH, CH2, N, NH, bond and absent;

[0028] m is 0, 1, 2, 3 or 4;

[0029] q is 0, 1 or 2;

[0030] L is 0, 1 or 2.

[0031] In an embodiment,  is one structure selected from the group consisting of is selected from the group consisting of

[0032] In an embodiment,

[0033] In an embodiment, R3 and R10 are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, C1-6 halo-alkylthio; (ii) C3-10 cycloalkyl, 5 to 10 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, C6-10 aryl, 5 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, optionally R3 is substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R3a.

[0034] In an embodiment, R3 and R10 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, C1-3 alkyl, C2-4 alkenyl, C1-3 alkylthio, C1-3 haloalkyl, C13 hydroxyalkyl, C1-3 aminoalkyl, C1-3 cyanoalkyl, C1-3 alkoxy, C1-3 alkoxyalkyl, C1-3 haloalkoxy, and C1-3 halo-alkylthio.

[0035] In an embodiment, R3 and R10 are each independently selected from the group consisting of methyl, hydrogen.

[0036] In an embodiment, R1a, R3a, R10a and R15a are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, C1-6 halo-alkylthio, azide, sulfonyl, amino-carbonyl (ii) C3-10 cycloalkyl, 3 to 10 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S, C6-10 aryl, 3 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, optionally R3a is substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R7.

[0037] In an embodiment, R1a, R3a, R10a and R15a are each independently selected from the group consisting of C1-3 alkyl, amino, amino-carbonyl, C2-4 alkenyl, sulfonyl, cyano, azide, 4-8 membered heterocyclyl containing 1, 2 or 3 heteroatoms selected from N, O or S, 5 membered heteroaryl containing 1, 2, 3 or 4 heteroatoms selected from N, O or S, optionally R3a is substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R7.

[0038] In an embodiment, R1a, R3a, R10a and R15a are each independently selected from the group consisting of –N3, –CH3, -NH2,  -CN,  optionally R3a is substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R7.

[0039] In an embodiment, R1a, R3a R10a and R15a are each independently selected form the group consisting of –N3, -CN, -CH3, -F,

[0040] In an embodiment, each R7 is independently is selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, C1-6 halo-alkylthio, azide, C1-3 alkyl-azide (ii) C3-10 cycloalkyl, -C1-3 alkyl-5 to 10 membered heterocyclyl, 5 to 10 membered heterocyclyl, the heterocyclyl contains 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, C6-10 aryl, 5 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S.

[0041] In an embodiment, each R7 is independently is selected from the group consisting of C1-3 alkyl, hydroxyl, halogen, C1 alkyl-azide, C1-3 alkylthio, C1-3 haloalkyl, C1-3 hydroxyalkyl, C1-3 aminoalkyl, C1-3 cyanoalkyl, C1-3 alkoxy, C1-3 alkoxyalkyl, C1-3 haloalkoxy, and C1-3 halo-alkylthio, C3-6 cycloalkyl, -methyl-6 membered heterocycle, 3 to 6 membered heterocyclyl, the heterocyclyl contains 1, 2 or 3 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, C6-10 aryl, 6 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S.

[0042] In an embodiment, each R7 is independently is selected from the group consisting of –F, methyl, -OH,  and phenyl.

[0043] In an embodiment, R4, R11 and R12a are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, C1-6 halo-alkylthio, azide, (ii) C3-10 cycloalkyl, 5 to 10 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, C6-10 aryl, 5 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S.

[0044] In an embodiment, R4, R11 and R12a are each independently selected from the group consisting of hydrogen, amino, C1-3 alkyl, hydroxyl, halogen, C1-3 alkylthio, C1-3 haloalkyl, C1-3 hydroxyalkyl, C1-3 aminoalkyl, C1-3 cyanoalkyl, C1-3 alkoxy, C1-3 alkoxyalkyl, C1-3 haloalkoxy, C3 cycloalkyl, C3-5 alkynyl and C1-3 halo-alkylthio.

[0045] In an embodiment, R4, R11 and R12a are each independently selected from the group consisting of hydrogen, -CH3, –OH, -NH2,

[0046] In an embodiment, R1 and R2 are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, deuteryl C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, amino-carbonyl, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, C1-6 halo-alkylthio, azide,  (ii) C3-10 cycloalkyl, 5 to 10 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, C6-10 aryl, 5 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S;

[0047] or R1 and R2 together with the atoms to which they are attached form a structure selected from the group consisting of C3-10 cycloalkyl, 5 to 10 membered heterocyclyl, C6-10 aryl and 5 to 10 membered heteroaryl, the heterocyclyl and heteroaryl are each independently containing 1, 2, 3, 4 or 5 heteroatoms selected from N, O or S, the cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl are each independently optionally substituted with 1, 2, 3, 4, or 5 of R1a.

[0048] In an embodiment, R1 and R2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, amino-carbonyl, C1-3 alkyl, deuteryl C1-3 alkyl, hydroxyl, halogen, amino, C1-3 alkylthio, C1-3 haloalkyl, C1-3 hydroxyalkyl, C1-3 aminoalkyl, C1-3 cyanoalkyl, C1-3 alkoxy, C1-3 alkoxyalkyl, C1-3 haloalkoxy, and C1-3 halo-alkylthio,

[0049] or R1 and R2 together with the atoms to which they are attached form a 3-6 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3 or 4 of heteroatoms selected from N, O or S, the 3-6 membered heterocyclyl is optionally substituted with 1, 2, 3 or 4 of R1a.

[0050] In an embodiment, R1 and R2 are each independently selected from the group consisting of –H, –CH3, -CD3, -NH2,  and –F;

[0051] or R1 and R2 together with the atoms to which they are attached form a structure of  which is optionally substituted with 1 of R1a.

[0052] In an embodiment, R5 and R6 are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, C1-6 halo-alkylthio, azide, (ii) C3-10 cycloalkyl, 3 to 10 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S, C6-10 aryl, 3 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S.

[0053] In an embodiment, R5 and R6 are each independently selected from the group consisting of C1-3 alkyl, hydroxyl, halogen, C1-3 alkylthio, C1-3 haloalkyl, C1-3 hydroxyalkyl, C1-3 aminoalkyl, C1-3 cyanoalkyl, C1-3 alkoxy, C1-3 alkoxyalkyl, C1-3 haloalkoxy, and C1-3 halo-alkylthio.

[0054] In an embodiment, R5 and R6 are each independently selected from the group consisting of –CH2CH3 and -OH.

[0055] In an embodiment, R14 and R15 are each independently selected from absent, hydrogen, deuterium, alkyl, amino, C1-3 alkyl-C3-6 cycloalkyl, 3-7 alkenyl; or R14 and R15 together with two adjacent atoms to which they are attached form a 6-8 membered cycloalkyl, 6-8 membered heterocyclyl.

[0056] In an embodiment, R14 is selected from absent, amino or hydrogen, and R15 is selected from absent, hydrogen, deuterium, C1-3 alkyl, C3-4 alkenyl, C1 alkyl-C3 cycloalkyl; or R14 and R15 together with two adjacent atoms to which they are attached form a 7 membered cycloalkyl, or 7 membered heterocyclyl.

[0057] In an embodiment, R14 is –H or amino, R15 is –H,  or –CH2CH3; or R14 and R15 together with two adjacent atoms to which they are attached form

[0058] In an embodiment, R16 and R17 are each independently selected from the group consisting of absenet or OXO; R16 and R17 together with the adjacent atom to which they are attached form a C3-6 cycloalkyl or a C3-6 heterocyclyl, heterocyclyl containing 1 or 2 heteroatoms of O.

[0059] In an embodiment, R16 and R17 together with the adjacent atom to which they are attached form a C4 heterocyclyl, heterocyclyl containing 1 heteroatom of O.

[0060] In an embodiment, R16 and R17 together with the adjacent atom to which they are attached form *indicates the adjacent atom.

[0061] In an embodiment, R1 and R14 together with the adjacent atom to which they are attached form a C5-7 cycloalkyl or a C5-7 heterocyclyl, heterocyclyl containing 1 or 2 heteroatoms of O.

[0062] In an embodiment, R1 and R14 together with the adjacent atom to which they are attached form a C6 heterocyclyl, heterocyclyl containing 1 heteroatom of O;

[0063] In an embodiment, R1 and R14 together with the adjacent atom to which they are attached form

[0064] In another aspect, the invention provides a linker-drug compound or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof, wherein the linker-drug conjugate comprises a formula of:

[0065] wherein R1 and R2 are as defined in formula (A) or formula (E) , R5 and R6 are as defined in formula (A) or formula (E) , R12 is as defined in formula (A) or formula (E) , R12a is as defined in formula (E) ;

[0066] S is a spacer unit connected to ligand or absent,

[0067] L is a linking unit with one terminus conjugated to R12 group of drug and one terminus conjugated to S or ligand

[0068] In some embodiment, the linker-drug compound comprises a formula of:

[0069] In some embodiment, L is represented by the formula L1-L2-L3-L4, L1 terminus is conjugated to S or ligand, L4 terminus is conjugated to R12 in drug.

[0070] In some embodiment, L4 terminus is conjugated to R4 group in R12.

[0071] In some embodiment L1 is represented by the formula: Y1-W1, Y1-W1-Y2-W2, Y1-W1-Y2-W2-Y3 or W1-Y1-W2-Y2-W3, Y1 and Y2 are each independently selected from the group consisting of absent, C3-10 cycloalkyl, 3 to 12 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4, 5 or 6 of heteroatoms independently selected from N, O or S (O) q, C5-10 aryl, and 3 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms independently selected from N, O or S (O) q, optionally cycloalkyl, heterocyclyl, aryl or heteroaryl is substituted with one or more substituents selected from the group consisting of OXO, hydrogen, deuterium, alkyl, azide, halogen, hydroxyl, alkenyl, alkynyl, cyano, amino, alkylthio, haloalkyl, haloalkoxy, hydroxyalkyl, aminoalkyl, cyanoalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl and -alkyl-heterocyclyl;

[0072] W1, W2 and W3 are each independently selected from the group consisting of absent, C1-12 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 12 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 6 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the C1-12 alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more R8 selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO, C1-12 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 12 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 6 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the C1-12 alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more OXO, hydrogen, halogen, hydroxyl, cyano, amino, alkyl, chloroalkyl, deuterated alkyl, alkoxy and cycloalkyl;

[0073] L2 is selected from the group consisting of absent, (OCH2CH2) p, W4, (OCH2CH2) pW4, wherein p is an integer from 1 to 20, W4 is selected from the group consisting of absent, C1-8 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 8 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 4 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the C1-8 alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more substituents selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO and C1-4 alky;

[0074] L3 is a peptide residue consisting of 2 to 8 amino acid residues or absent, wherein the amino acids are optionally further substitute by one or more substituent (s) selected from the group consisting of C (O) (CH2CH2O) z-alkyl, halogen, hydroxy, cyano, amino, alkyl, chloroalkyl, deuterated alkyl, alkoxy, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, alkyl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-heteroaryl and alkyl-heterocyclyl, wherein z is an integer from 1 to 20;

[0075] L4 is absent or represented by the formula: NR9-W5 or W5, wherein, R9 is selected from the group consisting of hydrogen, deuterium, alkyl, azide, halogen, hydroxyl, alkenyl, alkynyl, cyano, amino, alkylthio, haloalkyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, cyanoalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl and -alkyl-heterocyclyl; W5 is selected from the group consisting of absent, C1-12 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 12 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 6 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the C1-12 alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more substituents selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO, C1-12 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 12 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 6 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S.

[0076] In an embodiment, S is selected from the group consisting of absent, methylsulfony, Br, F, Cl, I and sulfur.

[0077] In an embodiment, S is selected from the group consisting of absent,  Br, I and Sulfur.

[0078] In an embodiment, Y1 and Y2 are each independently selected from the group consisting of absent, C5-6 cycloalkyl, 5 to 6 membered heterocyclyl containing 1, 2 or 3 heteroatoms independently selected from N, O or S, C5-6 ayl, and 5 to 6 membered heteroaryl containing 1, 2 or 3 heteroatoms independently selected from N, O or S, optionally cycloalkyl, heterocyclyl, aryl or heteroaryl is substituted with one or more substituents selected from the group consisting of OXO, hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, azide, C3-10 cycloalkyl, 3 to 10 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S, C6-10 aryl, 3 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S.

[0079] In an embodiment, Y1 and Y2 are each independently selected from the group consisting of is connected to S, W1 or W2. In an embodiment, W1, W2 and W3 are each independently selected from the group consisting of absent, C1-6 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 8 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 3 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more R8, each R8 is independently selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO, C1-12 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 12 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 3 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more OXO, hydrogen, halogen, hydroxyl, cyano, amino, C1-3 alkyl, C1-3 chloroalkyl, C1-3 deuterated alkyl, C1-3 alkoxy and C1-6 cycloalkyl.

[0080] In an embodiment, W1, W2 and W3 are each independently selected from the group consisting of absent,  *is connected to S , Y1 or Y2, R8 is independently selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO, and linear heteroalkyl comprising 8 to 12 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 2 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further independently substituted by one or more substitutions selected from OXO, hydrogen, halogen, hydroxyl, cyano, amino, C1-3 alkyl, C1-3 chloroalkyl, C1-3 deuterated alkyl, C1-3 alkoxy and C1-6 cycloalkyl.

[0081] In an embodiment, W1, W2 and W3 are each independently selected from the group consisting of absent,

[0082] -CH2CH2-,  *is connected to S , Y1 or Y2.

[0083] In an embodiment, L2 is selected from the group consisting of absent, (OCH2CH2) 2-8, W4, (OCH2CH2) 2-8W4, wherein W4 is selected from the group consisting of absent, C1-4 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 4 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 or 2 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more substituents selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO and C1-2 alky.

[0084] In an embodiment, L2 is selected from the group consisting of absent, -OCH2CH2-, -OCH2CH2W4-, (OCH2CH2) 2, (OCH2CH2) 2W4, (OCH2CH2) 4, (OCH2CH2) 4W4, (OCH2CH2) 8, (OCH2CH2) 8W4, wherein W4 is selected from the group consisting of absent, C (O) ,

[0085] In an embodiment, L3 is a peptide residue consisting of 2 to 6 amino acid residues, the amino acid residues are each independently selected from the group consisting of the residues of phenylalanine (Phe, F) , glycine (Gly, G) , valine (Val, V) , lysine (Lys, K) , citrulline, serine (Ser, S) , glutamic acid (Glu) , aspartic acid (Asp) , alanine (Ala, A) , leucine (Leu, L) , isoleucine (Ile, I) , tryptophane (Trp) , methionine (Met) , proline (Pro, P) , threonine (Thr, T) , cysteine (Cys, C) , tyrosine (Tyr, Y) , asparagine (Asn, N) , glutamine (Gln, Q) , histidine (His, H) , arginine (Arg, R) .

[0086] In an embodiment, L3 is a peptide residue consisting of 2 to 5 amino acid residues, the amino acid residues are each independently selected from the group consisting of the residues of Phe (F) , Ala (A) , Gly (G) , Val (V) , wherein the amino acids are optionally further substitute by one or more substituent (s) selected from the group consisting of C (O) - (CH2CH2O) z-CH3, wherein z is an integer from 4 to 16.

[0087] In an embodiment, L3 is selected from the group consisting of GGFG, VA, GFG, KGGFG, KVA, wherein Lys (K) is optionally further substitute by one or more substituent (s) selected from the group consisting of -C (O) - (CH2CH2O) z-CH3, wherein z is an integer from 4 to 12, preferably, z is an integer from 6-10, more preferably, z is 8.

[0088] In an embodiment, R9 is selected from the group consisting of hydrogen, deuterium, C1-3 alkyl, azide, halogen, hydroxyl, C1-3 alkenyl, C1-3 alkynyl, cyano, amino, C1-3 alkylthio, C1-3 haloalkyl, C1-3 hydroxyalkyl, C1-3 aminoalkyl, C1-3 cyanoalkyl, C1-3 alkoxy, C1-3 alkoxyalkyl, C3-8 cycloalkyl, 3 to 8 membered heterocyclyl containing 1, 2 or 3 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, C6-10 aryl, 3 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2 or 3 of heteroatoms selected from N, O or S; W5 is selected from the group consisting of absent, C1-3 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 6 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 3 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more substituents selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO, C1-3 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 6 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 3 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S.

[0089] In an embodiment, R9 is selected from the group consisting of hydrogen and deuterium, W5 is selected from absent and CH2.

[0090] In another aspect, the invention provides a ligand-drug conjugate or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof, wherein the ligand-drug conjugate comprises a formula of:

[0091] wherein R1, R2, R5, R6, R12, R12a are as defined in formula (A) or formula (E) ;

[0092] S is a spacer unit connected to ligand or absent,

[0093] L is a linking unit with one terminus conjugated to R12 group of drug and one terminus conjugated to S or ligand,

[0094] n is 1 to 10, which can be an integer or a decimal, preferably 2 to 10 such as 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0; more preferably, n is 6-10, such as 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, even more preferably, n is 7-9, such as 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0; most preferably, n is 7-8, such as 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0.

[0095] In an embodiment, the the ligand-drug conjugate comprises a formula of:

[0096] Wherein S is as defined in formula (F) or formula (G) , L is represented by the formula L1-L2-L3-L4, each of L1, L2, L3 and L4 is as defined in formula (F) or formula (G) ; n is 1 to 10, which can be an integer or a decimal, preferably 2 to 10 such as 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0; more preferably, n is 6-10, such as 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, even more preferably, n is 7-9, such as 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0; most preferably, n is 7-8, such as 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0.

[0097] In an embodiment, the ligand is an antibody or an antigen-binding fragment thereof, and the antibody is selected from the group consisting of chimeric antibody, humanized antibody and fully humanized antibody.

[0098] In an embodiment, the antibody or the antigen-binding fragment is targeting one or more targets selected from the group consisting of B7H3, B7H4, CD30, CD5, CD33, CD19, CD37, CD20, CD45, CD56, CD70, CD79b, CD117 / c-Kit, CD137 / 4-1BB, BCMA, CEA, EpCam, Nectin 4, MUC5AC, DLL3, CXCR2, gpNMB, FOLR1, ENPP3, CLDN23, GUCY2C, IL-4, IL-23, CTLA-4, EGFR, CLDN-6, Trop-2, CLDN 18.2, HER3, TIGIT, CDH17, PSMA, MSLN, HER2, c-MET, LILRB4, CD47, PD-1, PD-L1, OX40, IL-17A, TNF-α, RANKL, TSLP, CD38, STEAP1, CDH6, GPRC5D, ROR1, Mesothelin and IL23.

[0099] In an embodiment the ligand-drug conjugate is selected from:

[0100] wherein n is 1 to 10, which can be an integer or a decimal, preferably 2 to 10 such as 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0; more preferably, n is 6-10, such as 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, even more preferably, n is 7-9, such as 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0; most preferably, n is 7-8, such as 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0.

[0101] In another aspect, the invention provides a linker of formula: S-L1-L2-L3-L4-or -S-L1-L2-L3-L4-, or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof, for obtaining an ligand-drug conjugate in which a drug is conjugated to a ligand via the linker, wherein, S is as defined above, L1 is as defined above, L2 is as defined above, L3 is as defined above, L4 is as defined above.

[0102] In some embodiment, the linker is selected from:

[0103] In another aspect, the invention provides a pharmaceutical composition, comprising a therapeutically effective amount of the ligand-drug conjugate or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof according to the present disclosure, and one or more pharmaceutically acceptable carrier (s) , diluent (s) or excipient (s) .

[0104] In another aspect, the invention provides a method method for treating and / or preventing a tumor, comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of the ligand-drug conjugate or compound, or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, or the pharmaceutical composition comprising the same according to the present disclosure.

[0105] In another aspect, the invention provides a method for treating or preventing a cancer, and / or tumor comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of the ligand-drug conjugate or compound, or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, or the pharmaceutical composition comprising the same according to the present disclosure, the cancer is preferably selected from the group consisting of breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, uterine cancer, prostate cancer, kidney cancer, urethral cancer, bladder cancer, liver cancer, stomach cancer, endometrial cancer, salivary gland cancer, esophageal cancer, melanoma, glioma, neuroblastoma, sarcoma, lung cancer (for example, small cell lung cancer and non-small cell lung cancer) , colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, leukemia (for example, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, acute promyelocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia) , bone cancer, skin cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer and lymphoma (for example, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, or recurrent anaplastic large cell lymphoma) .

[0106] Advantageous Effects of the Invention:

[0107] The payloads provided by the present disclosure have good in-vitro cytotoxicity activity compared with positive control. Due to faster clearance in vivo, the payload provided by this invention offers less toxic as a free payload and thus greater advantages in terms of safety compared tothe prior art.

[0108] The ADCs formed by conjugating the payload provided by the present disclosure to an antibody via a linker have better in-vitro cytotoxicity, serum stability, PK profile in mouse and in-vivo inhibition on tumor growth compared with positive control. Due to superior stability and faster clearance of free payload, the ADCs provided by this invention offers greater advantages in terms of anti-tunor effect and safety compared to the prior art.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0109] Figure 1. C11 show better invitro cytotoxicity compared with MK in (A) SKBR3, (B) NCI-H1975, (C) NCI-H460 cells

[0110] Figure 2. C115 show better in-vitro cytotoxicity compared with Dxd in (A) NCI-H1975, (B) SKBR3, (C) NCI-H460 cells

[0111] Figure 3. EHW1-C13 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in (A) A431, (B) BxPC3, (C) NCI-H1975 cells.

[0112] Figure 4. EHW1-C57 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in (A) A431, (B) BxPC3, (C) NCI-H1975 cells.

[0113] Figure 5. EHW1-C121 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in (A) A431, (B) BxPC3, (C) NCI-H1975 cells.

[0114] Figure 6. EHW1-C122 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in (A) A431, (B) BxPC3, (C) NCI-H1975 cells.

[0115] Figure 7. EHW1-C124 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in (A) A431 (B) BxPC3 (C) NCI-H1975 cells

[0116] Figure 8. (A) EHW4-C13, EHW4-C57, EHW4-C120 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in NCI-H1975 cells; (B) EHW4-C13, EHW4-C54, EHW4-C53 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in NCI-H1975 cells.

[0117] Figure 9. B7H3-C125 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in (A) Detroit and (B) NCI-H460 cells.

[0118] Figure 10. (A) EHW4-C13, EHW4-C57, EHW4-C120 showed stronger inhibition on tumor growth than Deruxtecan conjugated ADC in NCI-H1975 mouse model; (B) EHW4-C54, EHW4-C53 showed stronger inhibition on tumor growth than Deruxtecan conjugated ADC in NCI-H1975 mouse model

[0119] Figure 11. (A) EHW4-C53 showed stronger inhibition on tumor growth than Deruxtecan conjugated ADCs in MX-1 mouse model at 1mg / kg and 3mg / kg dose; (B) EHW4-C13 and EHW4-C53 showed stronger inhibition on tumor growth than Deruxtecan conjugated ADCs in MX-1 mouse model at 3mg / kg dose

[0120] Figure 12. (A) B7H3-C117, B7H3-C118, B7H3-C119, B7H3-C13 showed stronger inhibition on tumor growth than Deruxtecan conjugated ADC in NCI-H1975 mouse model; (B) B7H3-C117, B7H3-C118, B7H3-C119, B7H3-C13 showed good safety in NCI-H1975 mouse model (C) tumor size comparison of B7H3-C117, B7H3-C118, B7H3-C119, B7H3-C13 to Deruxtecan conjugated ADC

[0121] Figure 13. B7H3-C117, B7H3-C118, B7H3-C119, B7H3-C13 showed stronger inhibition on tumor growth than Deruxtecan conjugated ADCs in Calu-6 mouse model

[0122] Figure 14. B7H3-C117, B7H3-C118, B7H3-C119, B7H3-C13 showed better stability in human, monkey and mouse serum compared to Deruxtecan conjugated ADCs.

[0123] Figure 15. EHW1-117 showed better in-vitro cytotoxicity compared to EHW1-117-Dxd in (A) NCI-H1975 cells, (B) BxPC3 cellsDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0124] DEFINITIONS

[0125] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by those of ordinary skill in the art to which the present disclosure belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can also be used to implement or test the present disclosure, preferred methods and materials are described herein. In describing and claiming the present disclosure, the following terms are used in accordance with the definitions below.

[0126] Unless otherwise stated, the terms used in the specification and claims have the following meanings.

[0127] “Ligand” refers to a macromolecule compound capable of recognizing and binding to an antigen or receptor associated with a target cell. The role of the ligand is to deliver the drug to the target cell population that binds to the ligand. Such ligands include, but are not limited to, protein hormones, lectins, growth factors, antibodies, or other molecules that can bind to cells. In an embodiment of the present disclosure, the ligand is represented by Pc. The ligand can form a bond with the linking unit via a heteroatom on the ligand. The ligand is preferably an antibody or an antigen-binding fragment thereof. The antibody is selected from the group consisting of chimeric antibody, humanized antibody, fully humanized antibody or murine antibody, and preferably a monoclonal antibody.

[0128] The term “drug” refers to a cytotoxic drug or an immunomodulatory agent. The cytotoxic drug may have a chemical molecule within the tumor cell that is strong enough to disrupt its normal growth. The cytotoxic drug can kill tumor cells in principle at a sufficiently high concentration; however, due to lack of specificity, the cytotoxic drug can cause apoptosis of normal cells while killing tumor cells, resulting in serious side effects. The cytotoxic drug includes toxins, such as small molecule toxins or enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, radioisotopes (e.g., At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 and radioactive isotopes of Lu) , toxic drugs, chemotherapeutic drugs, antibiotics and nucleolytic enzymes. The immunomodulatory agent is an inhibitor of immune checkpoint molecules. In some embodiments of the present disclosure, the drug is denoted as D and belongs to an immunomodulatory agent, in particular a TLR8 agonist.

[0129] The term “linker unit” , “linker” or “linker fragment” refers to a chemical structural fragment or bond, which is linked to a ligand at one end and linked to a drug at the other end, and also may be linked to other linkers and then linked to the drug.

[0130] The linker may comprise one or more linker components. Exemplary linker components include 6-maleimidocaproyl (MC) , maleimidopropionyl (MP) , valine-citrulline (Val-Cit or vc) , alanine-phenylalanine (ala-phe) , p-aminobenzyloxycarbonyl (PAB) , and those derived from coupling to a linker reagent: N-succinimidyl 4- (2-pyridylthio) pentanoate (SPP) , N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate (SMCC, also referred to herein as MCC) , and N-succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate (SIAB) . The linker can include a stretching unit, a spacer unit, an amino acid unit and an extension unit. The linker may be synthesized using methods known in the art, such as those described in US2005-0238649A1. The linker may be a “cleavable linker” favoring the release of drugs in cells. For example, acid-labile linkers (e.g., hydrazones) , protease-sensitive (e.g., peptidase-sensitive) linkers, photolabile linkers, dimethyl linkers or disulfide-containing linkers can be used.

[0131] The term “extension unit” refers to a chemical structural fragment which covalently links to an antibody through carbon atoms at one end and is linked to an amino acid unit, a disulfide moiety, a sulfonamide moiety or a non-peptide chemical moiety at the other end.

[0132] The term “spacer unit” is a bifunctional compound structural fragment that can be used to couple an amino acid unit to a cytotoxic drug to form an antibody-drug conjugate, in such a way that the cytotoxic drug is selectively linked to the amino acid unit.

[0133] The term “antibody-drug conjugate” means that a ligand is linked to a biologically active drug by a stable linking unit. In the present disclosure, “antibody-drug conjugate” (ADC) means that an antibody is linked to a biologically active toxic drug by a stable linking unit. The term "antibody" is used in the broadest sense and encompasses various antibody structures, including but not limited to monoclonal antibodies, polyclonal antibodies; monospecific antibodies, multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies) , full-length antibodies and antibody fragments (or antigen-binding fragments, or antigen-binding portions) , so long as they exhibit the desired antigen-binding activity.

[0134] The term “DAR” may also be represented as the drug-to-antibody ratio. The drug loading may range from 1 to 20, preferably from 1 to 10 cytotoxic drugs (D) attached per antibody (Ab) . In embodiments of the present disclosure, the drug loading is represented as k, and may illustratively be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, or an average of any two values; preferably an average of 1 to 10, and more preferably an average of 1 to 8, or 2 to 8, or 2 to 7, or 3 to 8, or 3 to 7, or 3 to 6, or 4 to 7, or 4 to 6, or 4 to 5. The mean number of drugs per ADC molecule after coupling reactions can be characterized by conventional methods such as UV / visible spectroscopy, mass spectrometry, ELISA assays, monoclonal antibody molecule size variant assay (CE-SDS) and HPLC.

[0135] The following non-limiting methods can be used to control the DAR of the antibody-drug conjugates:

[0136] (1) controlling the molar ratio of the linking reagent to the monoclonal antibody,

[0137] (2) controlling the reaction time and temperature,

[0138] (3) selecting different reaction reagents.

[0139] The term “antibody” refers to immunoglobulin, a four-peptide chain structure connected together by interchain disulfide bond between two identical heavy chains and two identical light chains. Different immunoglobulin heavy chain constant regions exhibit different amino acid compositions and sequences, hence present different antigenicity. Accordingly, immunoglobulins can be divided into five types, or called immunoglobulin isotypes, namely IgM, IgD, IgG, IgA and IgE, with corresponding heavy chain μ, γ, α and ε, respectively. According to the amino acid composition of hinge region and the number and location of heavy chain disulfide bonds, the same type of Ig can further be divided into different sub-types, for example, IgG can be divided into IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. Light chain can be divided into κ or λ chain based on different constant region. Each five types of Ig can have a κ or λ chain.

[0140] The term “antigen binding fragment” refers to one or more fragments of an antibody retaining the specific binding ability to the antigen. It has been shown that fragments of full-length antibody can be used to achieve the function of binding with an antigen. The examples of binding fragments in the term “antigen binding fragment” include (i) Fab fragment, a monovalent fragment composed of VL, VH, CL and CH1 domain; (ii) F (ab′) 2 fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments connected by a disulphide bond in the hinge region; (iii) Fd fragment, consisting of VH and CH1 domains; (iv) Fv fragment, consisting of VH and VL domains of one-arm antibody; (v) single domain or dAb fragment (Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546) composed of VH domain; and (vi) an isolated complementary determining region (CDR) or (vii) a combination of two or more isolated CDRs optionally conneted by a synthetic linker. In addition, although the VL domain and VH domain of the Fv fragment are encoded by two separate genes, they can be connected by a synthetic linker by using recombinant methods, thereby generating a single protein chain of a monovalent molecular formed by pairing the VL and VH domain (referred to as single chain Fv (scFv) ; see, e.g., Bird et al. (1988) Science: 242: 423-426, and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883) . This single chain antibody is also intended to be included in the term “antigen binding fragment” of the antibody. Such antibody fragments are obtained using conventional techniques known by those skilled in the art, and screened for functional fragments by using the same method as that for an intact antibody. Antigen binding sites can be produced by recombinant DNA technology or by enzymatic or chemical disruption of an intact immunoglobulin. Antibodies can be antibodies of different isotypes, e.g., IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 subtype) , IgA1, IgA2, IgD, IgE or IgM antibody.

[0141] Fab is an antibody fragment obtained by treating an IgG antibody molecule with a papain (which cleaves the amino acid residue at position 224 of the H chain) . The Fab fragment has a molecular weight of about 50,000 and has antigen binding activity, in which about a half of the N-terminal side of H chain and the entire L chain are bound together through a disulfide bond.

[0142] F (ab′) 2 is an antibody fragment obtained by digesting the downstream part of the two disulfide bonds in the hinge region of IgG with pepsin, which has a molecular weight of about 100,000 and has antigen binding activity and comprises two Fab regions which are bound at the hinge position.

[0143] Fab′ is an antibody fragment obtained by cleaving the disulfide bond at the hinge region of the above F (ab′) 2, which has a molecular weight of about 50,000 and has antigen binding activity.

[0144] Moreover, the Fab′ can be produced by inserting DNA encoding Fab′ fragment of the antibody into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector which is then introduced into a prokaryote or eukaryote to express the Fab′.

[0145] The term “CDR” refers to one of the six hypervariable regions within the variable domain of an antibody that primarily contributes to antigen binding. One of the most commonly used definitions for the six CDRs is provided by Kabat E. A. et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242. As used herein, the Kabat definition of CDR only applies to CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable domain (CDR L1, CDR L2, CDR L3 or L1, L2, L3) , as well as CDR2 and CDR3 of heavy chain variable domain (CDR H2, CDR H3 or H2, H3) .

[0146] The term “epitope” or “antigenic determinant” refers to a site on an antigen to which an immunoglobulin or antibody specifically binds. Epitopes generally comprise at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 contiguous or non-contiguous amino acids in a unique spatial conformation (see, e.g., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996) ) .

[0147] The terms “specific binding” , “selective binding” , “selectively bind” and “specifically bind” refer to the binding of an antibody to an epitope on a predetermined antigen. Typically, the antibody binds with an affinity (KD) of less than about 10-7M, such as approximately less than about 10-8 M, 10-9M or 10-10 M or less.

[0148] Methods for producing and purifying antibodies and antigen binding fragments are well known in the art, such as Cold Spring Harbor Antibody Technical Guide, Chapters 5-8 and 15. The antigen binding fragment can also be prepared by conventional methods. The antibodies or antigen binding fragments of the invention are genetically engineered to add one or more human FR regions in non-human CDR regions. The human FR germline sequence (s) can be obtained by aligning IMGT human antibody variable germlines gene databases and MOE software from the ImMunoGeneTics (IMGT) website at http:  / / imgt. cines. fr or from the Journal of Immunoglobulins 20011SBN012441351.

[0149] The engineered antibody or antigen binding fragment of the present disclosure can be prepared and purified by conventional methods. For example, cDNA sequence (s) encoding a heavy chain and a light chain can be cloned and recombined into a GS expression vector. The recombinant immunoglobulin expression vector can be stably transfected in CHO cells. As a more recommended existing technology, mammalian expression systems can result in glycosylation of antibodies, particularly at the highly conserved N-terminal site of the Fc region. Positive clones are expanded in serum-free medium in a bioreactor to produce antibodies. The culture medium containing the secreted antibody can be purified by conventional technique. For example, purification is carried out using an A or G Sepharose FF column that contains an adjusted buffer. The non-specifically bound components are removed by eluting. The bound antibody is eluted by a pH gradient method, and the antibody fragments are detected by SDS-PAGE and collected. The antibody can be filtered and concentrated by a conventional method. Soluble aggregate and multimers can also be removed by conventional methods such as size exclusion or ion exchange. The resulting product needs to be frozen immediately, such as at -70℃., or lyophilization.

[0150] “Alkyl” refers to a saturated aliphatic hydrocarbon group including C1-C20 straight chain and branched chain groups. Preferably an alkyl group is an alkyl having 1 to 12, sometimes preferably 1 to 6, sometimes more preferably 1 to 4, carbon atoms. Representative examples include, but are not limited to methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, 1, 1-dimethyl propyl, 1, 2-dimethyl propyl, 2, 2-dimethyl propyl, 1-ethyl propyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, n-hexyl, 1-ethyl-2-methylpropyl, 1, 1, 2-trimethylpropyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 2-dimethylbutyl, 2, 2-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl, 2-ethylbutyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 4-methylpentyl, 2, 3-dimethylbutyl, n-heptyl, 2-methylhexyl, 3-methylhexyl, 4-methylhexyl, 5-methylhexyl, 2, 3-dimethylpentyl, 2, 4-dimethylpentyl, 2, 2-dimethylpentyl, 3, 3-dimethylpentyl, 2-ethylpentyl, 3-ethylpentyl, n-octyl, 2, 3-dimethylhexyl, 2, 4-dimethylhexyl, 2, 5-dimethylhexyl, 2, 2-dimethylhexyl, 3, 3-dimethylhexyl, 4, 4-dimethylhexyl, 2-ethylhexyl, 3-ethylhexyl, 4-ethylhexyl, 2-methyl-2-ethylpentyl, 2-methyl-3-ethylpentyl, n-nonyl, 2-methyl-2-ethylhexyl, 2-methyl-3-ethylhexyl, 2, 2-diethylpentyl, n-decyl, 3, 3-diethylhexyl, 2, 2-diethylhexyl, and the isomers of branched chain thereof. More preferably an alkyl group is a lower alkyl having 1 to 6 carbon atoms. Representative examples include, but are not limited to, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, 1, 1-dimethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, 2, 2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, n-hexyl, 1-ethyl-2-methylpropyl, 1, 1, 2-trimethylpropyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 2-dimethylbutyl, 2, 2-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl, 2-ethylbutyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 4-methylpentyl, 2, 3-dimethylbutyl, etc. The alkyl group can be substituted or unsubstituted. When substituted, the substituent group (s) can be substituted at any available connection point, preferably the substituent group (s) is 1, 2, 3, 4 or 5 substituents independently selected from the group consisting of alkyl, halogen, alkoxy, alkenyl, alkynyl, alkylsulfo, alkylamino, thiol, hydroxy, nitro, cyano, amino, cycloalkyl, heterocyclic alkyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxyl, heterocylic, cycloalkylthio, heterocylic alkylthio and oxo group.

[0151] “Alkenyl” refers to an alkyl defined as above that has at least two carbon atoms and at least one carbon-carbon double bond, for example, vinyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-, 2-, or 3-butenyl, etc., preferably C2-20 alkenyl, more preferably C2-12 alkenyl, and most preferably C2-6 alkenyl. The alkenyl group can be substituted or unsubstituted. When substituted, the substituent group (s) is preferably one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, group (s) independently selected from the group consisting of alkyl, halogen, alkoxy, alkenyl, alkynyl, alkylsulfo, alkylamino, thiol, hydroxy, nitro, cyano, amino, cycloalkyl, heterocyclic alkyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxyl, heterocylic, cycloalkylthio, heterocylic alkylthio and oxo group.

[0152] “Alkynyl” refers to an alkyl defined as above that has at least two carbon atoms and at least one carbon-carbon triple bond, for example, ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 1-, 2-, or 3-butynyl etc., preferably C2-20 alkynyl, more preferably C2-12 alkynyl, and most preferably C2-6 alkynyl. The alkynyl group can be substituted or unsubstituted. When substituted, the substituent group (s) is preferably one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, group (s) independently selected from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, alkylsulfo, alkylamino, halogen, thiol, hydroxy, nitro, cyano, cycloalkyl, heterocyclic alkyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxyl, heterocylic alkoxyl, cycloalkylthio and heterocylic alkylthio.

[0153] “Alkylene” refers to a saturated linear or branched aliphatic hydrocarbon group, wherein having 2 residues derived by removing two hydrogen atoms from the same carbon atom of the parent alkane or two different carbon atoms. The straight or branched chain group containing 1 to 20 carbon atoms, preferably has 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 6 carbon atoms. Non-limiting examples of alkylene groups include, but are not limited to, methylene (-CH2-) , 1, 1-ethylene (-CH (CH3) -) , 1, 2-ethylene (-CH2CH2) -, 1, 1-propylene (-CH (CH2CH3) -) , 1, 2-propylene (-CH2CH (CH3) -) , 1, 3-propylene (-CH2CH2CH2-) , 1, 4-butylidene (-CH2CH2CH2CH2-) etc. The alkylene group can be substituted or unsubstituted. When substituted, the substituent group (s) is preferably one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, group (s) independently selected from the group consisting of selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, alkylsulfo, alkylamino, halogen, thiol, hydroxy, nitro, cyano, cycloalkyl, heterocyclic alkyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxyl, heterocylic alkoxyl, cycloalkylthio and heterocylic alkylthio.

[0154] “Alkenylene” refers to an alkylene defined as above that has at least two carbon atoms and at least one carbon-carbon double bond, preferably C2-20 alkenylene, more preferably C2-12 alkenylene, and most preferably C2-6 alkenylene. Non-limiting examples of alkenylene groups include, but are not limited to, -CH=CH-, -CH=CHCH2-, -CH=CHCH2CH2-, -CH2CH=CHCH2-etc. The alkenylene group can be substituted or unsubstituted. When substituted, the substituent group (s) is preferably one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, group (s) independently selected from the group consisting of selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, alkylsulfo, alkylamino, halogen, thiol, hydroxy, nitro, cyano, cycloalkyl, heterocyclic alkyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxyl, heterocylic alkoxyl, cycloalkylthio and heterocylic alkylthio.

[0155] “Alkynylene” refers to an alkynyl defined as above that has at least two carbon atoms and at least one carbon-carbon triple bond, preferably C2-20 alkynylene, more preferably C2-12 alkynylene, and most preferably C2-6 alkynylene. Non-limiting examples of alkenylene groups include, but are not limited to, -CH≡CH-, -CH≡CHCH2-, -CH≡CHCH2CH2-, -CH2CH≡CHCH2-etc. The alkynylene group can be substituted or unsubstituted. When substituted, the substituent group (s) is preferably one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, group (s) independently selected from the group consisting of selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, alkylsulfo, alkylamino, halogen, thiol, hydroxy, nitro, cyano, cycloalkyl, heterocyclic alkyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxyl, heterocylic alkoxyl, cycloalkylthio and heterocylic alkylthio.

[0156] The term "alkoxyalkyl, " as used herein, refers to an alkoxy group attached through its oxygen atom to an alkyl group, which is attached to the parent molecular moiety through a carbon atom, for example, methoxymethyl group (-CH2OCH3) . For example, C2-4 alkoxyalkyl" denotes alkoxyalkyl groups with two to four carbon atoms, such as -CH2OCH3, -CH2CH2OCH3, -CH2OCH2CH3, and -CH2CH2OCH2CH3.

[0157] “Cycloalkyl” refers to a saturated and / or partially unsaturated monocyclic or polycyclic hydrocarbon group having 3 to 20 carbon atoms, preferably 3 to 12 carbon atoms, more preferably 3 to 10 carbon atoms, and most preferably 3 to 8 carbon atoms or 3 to 6 carbon atoms. Representative examples of monocyclic cycloalkyls include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclopentenyl, cyclohexyl, cyclohexenyl, cyclohexadienyl, cycloheptyl, cycloheptatrienyl, cyclooctyl, etc. Polycyclic cycloalkyl includes a cycloalkyl having a spiro ring, fused ring or bridged ring.

[0158] “Spiro Cycloalkyl” refers to a 5 to 20 membered polycyclic group with rings connected through one common carbon atom (called a spiro atom) , wherein one or more rings can contain 1, 2, 3, 4 or 5 double bonds, but none of the rings has a completely conjugated pi-electron system. Preferably a spiro cycloalkyl is 6 to 14 membered, and more preferably 7 to 10 membered. According to the number of common spiro atoms, a spiro cycloalkyl is divided into mono-spiro cycloalkyl, di-spiro cycloalkyl, or poly-spiro cycloalkyl, and preferably refers to a mono-spiro cycloalkyl or di-spiro cycloalkyl, more preferably 4-membered / 4-membered, 4-membered / 5-membered, 4-membered / 6-membered, 5-membered / 5-membered, or 5-membered / 6-membered mono-spiro cycloalkyl. Representative examples of spiro cycloalkyl include, but are not limited to the following substituents:

[0159] “Fused Cycloalkyl” refers to a 5 to 20 membered polycyclic hydrocarbon group, wherein each ring in the system shares an adjacent pair of carbon atoms with another ring, wherein one or more rings can contain 1, 2, 3, 4 or 5 double bonds, but none of the rings has a completely conjugated pi-electron system. Preferably, a fused cycloalkyl group is 6 to 14 membered, more preferably 7 to 10 membered. According to the number of membered rings, fused cycloalkyl is divided into bicyclic, tricyclic, tetracyclic or polycyclic fused cycloalkyl, and preferably refers to a bicyclic or tricyclic fused cycloalkyl, more preferably 5-membered / 5-membered, or 5-membered / 6-membered bicyclic fused cycloalkyl. Representative examples of fused cycloalkyls include, but are not limited to, the following substituents:

[0160] “Bridged Cycloalkyl” refers to a 5 to 20 membered polycyclic hydrocarbon group, wherein every two rings in the system share two disconnected carbon atoms. The rings can have 1, 2, 3, 4 or 5 double bonds, but have no completely conjugated pi-electron system. Preferably, a bridged cycloalkyl is 6 to 14 membered, and more preferably 7 to 10 membered. According to the number of membered rings, bridged cycloalkyl is divided into bicyclic, tricyclic, tetracyclic or polycyclic bridged cycloalkyl, and preferably refers to a bicyclic, tricyclic or tetracyclic bridged cycloalkyl, more preferably a bicyclic or tricyclic bridged cycloalkyl. Representative examples of bridged cycloalkyls include, but are not limited to, the following substituents:

[0161] The cycloalkyl can be fused to the ring of an aryl, heteroaryl or heterocyclic alkyl, wherein the ring bound to the parent structure is cycloalkyl. Representative examples include, but are not limited to indanylacetic, tetrahydronaphthalene, benzocycloheptyl and so on. The cycloalkyl is optionally substituted or unsubstituted. When substituted, the substituent group (s) is preferably one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, substituents independently selected from the group consisting of alkyl, halogen, alkoxy, alkenyl, alkynyl, alkylsulfo, alkylamino, thiol, hydroxy, nitro, cyano, amino, cycloalkyl, heterocyclic alkyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxyl, heterocylic, cycloalkylthio, heterocylic alkylthio and oxo group.

[0162] “Heterocyclyl” refers to a 3 to 20 membered saturated and / or partially unsaturated monocyclic or polycyclic hydrocarbon group having one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, heteroatoms selected from the group consisting of N, O, and S (O) q (wherein q is 0, 1, or 2) as ring atoms, but excluding -O-O-, -O-S-or -S-S-in the ring, the remaining ring atoms being C. Preferably, heterocyclyl is a 3 to 12 membered having 1 to 4 heteroatoms; more preferably a 3 to 10 membered having 1 to 3 heteroatoms; more preferably a 4 to 8 membered having 1 to 3 heteroatoms; most preferably a 5 to 6 membered having 1 to 2 heteroatoms. Representative examples of monocyclic heterocyclyls include, but are not limited to, oxetanyl, azabutyl, pyrrolidyl, piperidyl, piperazinyl, morpholinyl, sulfo-morpholinyl, homopiperazinyl, and so on. Polycyclic heterocyclyl includes the heterocyclyl having a spiro ring, fused ring or bridged ring.

[0163] “Spiro heterocyclyl” refers to a 5 to 20 membered polycyclic heterocyclyl with rings connected through one common carbon atom (called a spiro atom) , wherein said rings have one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, heteroatoms selected from the group consisting of N, O, and S (O) q (wherein q is 0, 1 or 2) as ring atoms, the remaining ring atoms being C, wherein one or more rings can contain 1, 2, 3, 4 or 5 double bonds, but none of the rings has a completely conjugated pi-electron system. Preferably a spiro heterocyclyl is 6 to 14 membered, and more preferably 7 to 10 membered. According to the number of common spiro atoms, spiro heterocyclyl is divided into mono-spiro heterocyclyl, di-spiro heterocyclyl, or poly-spiro heterocyclyl, and preferably refers to mono-spiro heterocyclyl or di-spiro heterocyclyl, more preferably 4-membered / 4-membered, 4-membered / 5-membered, 4-membered / 6-membered, 5-membered / 5-membered, or 5-membered / 6-membered mono-spiro heterocyclyl. Representative examples of spiro heterocyclyl include, but are not limited to the following substituents:

[0164] “Fused Heterocyclyl” refers to a 5 to 20 membered polycyclic heterocyclyl group, wherein each ring in the system shares an adjacent pair of carbon atoms with the other ring, wherein one or more rings can contain 1, 2, 3, 4 or 5 double bonds, but none of the rings has a completely conjugated pi-electron system, and wherein said rings have one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, heteroatoms selected from the group consisting of N, O, and S (O) p (wherein p is 0, 1, or 2) as ring atoms, the remaining ring atoms being C. Preferably a fused heterocyclyl is 6 to 14 membered, and more preferably 7 to 10 membered. According to the number of membered rings, fused heterocyclyl is divided into bicyclic, tricyclic, tetracyclic or polycyclic fused heterocyclyl, preferably refers to bicyclic or tricyclic fused heterocyclyl, more preferably 5-membered / 5-membered, or 5-membered / 6-membered bicyclic fused heterocyclyl. Representative examples of fused heterocyclyl include, but are not limited to, the following substituents:

[0165] “Bridged Heterocyclyl” refers to a 5 to 14 membered polycyclic heterocyclic alkyl group, wherein every two rings in the system share two disconnected atoms, the rings can have 1, 2, 3, 4 or 5 double bonds, but have no completely conjugated pi-electron system, and the rings have 1, 2, 3, 4 or 5 heteroatoms selected from the group consisting of N, O, and S (O) q (wherein q is 0, 1, or 2) as ring atoms, the remaining ring atoms being C. Preferably a bridged heterocyclyl is 6 to 14 membered, and more preferably 7 to 10 membered. According to the number of membered rings, bridged heterocyclyl is divided into bicyclic, tricyclic, tetracyclic or polycyclic bridged heterocyclyl, and preferably refers to bicyclic, tricyclic or tetracyclic bridged heterocyclyl, more preferably bicyclic or tricyclic bridged heterocyclyl. Representative examples of bridged heterocyclyl include, but are not limited to, the following substituents:

[0166] The ring of said heterocyclyl can be fused to the ring of an aryl, heteroaryl or cycloalkyl, wherein the ring bound to the parent structure is heterocyclyl. Representative examples include, but are not limited to the following substituents:

[0167] etc.

[0168] The heterocyclyl is optionally substituted or unsubstituted. When substituted, the substituent group (s) is preferably one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, group (s) independently selected from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, alkylsulfo, alkylamino, halogen, thiol, hydroxy, nitro, cyano, cycloalkyl, heterocyclic alkyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxyl, heterocylic alkoxyl, cycloalkylthio, heterocylic alkylthio.

[0169] “Aryl” refers to a 6 to 14 membered all-carbon monocyclic ring or a polycyclic fused ring (a"fused" ring system means that each ring in the system shares an adjacent pair of carbon atoms with another ring in the system) group, and has a completely conjugated pi-electron system. Preferably aryl is 6 to 10 membered, such as phenyl and naphthyl, most preferably phenyl. The aryl can be fused to the ring of heteroaryl, heterocyclyl or cycloalkyl, wherein the ring bound to parent structure is aryl. Representative examples include, but are not limited to, the following substituents:

[0170] The aryl group can be substituted or unsubstituted. When substituted, the substituent group (s) is preferably one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, substituents independently selected from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, alkylsulfo, alkylamino, halogen, thiol, hydroxy, nitro, cyano, cycloalkyl, heterocyclic alkyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxyl, heterocylic alkoxyl, cycloalkylthio and heterocylic alkylthio.

[0171] “Heteroaryl” refers to an aryl system having 1 to 4 heteroatoms selected from the group consisting of O, S and N as ring atoms and having 5 to 14 annular atoms. Preferably a heteroaryl is 5-to 10-membered, more preferably 5-or 6-membered, for example, thiadiazolyl, pyrazolyl, oxazolyl, oxadiazolyl, imidazolyl, triazolyl, thiazolyl, furyl, thienyl, pyridyl, pyrrolyl, N-alkyl pyrrolyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, imidazolyl, tetrazolyl, and the like. The heteroaryl can be fused with the ring of an aryl, heterocyclyl or cycloalkyl, wherein the ring bound to parent structure is heteroaryl. Representative examples include, but are not limited to, the following substituents:

[0172] The heteroaryl group can be substituted or unsubstituted. When substituted, the substituent group (s) is preferably one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, substituents independently selected from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, alkylsulfo, alkylamino, halogen, thiol, hydroxy, nitro, cyano, cycloalkyl, heterocyclic alkyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxyl, heterocylic alkoxyl, cycloalkylthio, heterocylic alkylthio.

[0173] “Alkoxy” refers to both an -O- (alkyl) and an -O- (unsubstituted cycloalkyl) group, wherein the alkyl is defined as above. Representative examples include, but are not limited to, methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, cyclopropyloxy, cyclobutyloxy, cyclopentyloxy, cyclohexyloxy, and the like. The alkoxyl can be substituted or unsubstituted. When substituted, the substituent is preferably one or more, sometimes preferably one to five, sometimes more preferably one to three, substituents independently selected from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, alkylsulfo, alkylamino, halogen, thiol, hydroxy, nitro, cyano, cycloalkyl, heterocyclic alkyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxyl, heterocylic alkoxyl, cycloalkylthio and heterocylic alkylthio.

[0174] “Bond” refers to a covalent bond using a sign of “-” .

[0175] "Hydroxyalkyl" refers to an alkyl group substituted by a hydroxy group, wherein alkyl is as defined above.

[0176] “Hydroxy” refers to an -OH group.

[0177] “Halogen” refers to fluoro, chloro, bromo or iodo atoms.

[0178] “Amino” refers to a -NH2 group.

[0179] “Cyano” refers to a -CN group.

[0180] “Nitro” refers to a -NO2 group.

[0181] “Oxo group” refers to a =O group.

[0182] “Carboxyl” refers to a -C (O) OH group.

[0183] “Alkoxycarbonyl” refers to a -C (O) O (alkyl) or (cycloalkyl) group, wherein the alkyl and cycloalkyl are defined as above.

[0184] “Optional” or “optionally” means that the event or circumstance described subsequently can, but need not, occur, and the description includes the instances in which the event or circumstance may or may not occur. For example, “the heterocyclic group optionally substituted by an alkyl” means that an alkyl group can be, but need not be, present, and the description includes the case of the heterocyclic group being substituted with an alkyl and the heterocyclic group being not substituted with an alkyl.

[0185] “Substituted” refers to one or more hydrogen atoms in the group, preferably up to 5, more preferably 1 to 3 hydrogen atoms, independently substituted with a corresponding number of substituents. It goes without saying that the substituents exist in their only possible chemical position. The person skilled in the art is able to determine if the substitution is possible or impossible without paying excessive efforts by experiment or theory. For example, the combination of amino or hydroxyl group having free hydrogen and carbon atoms having unsaturated bonds (such as olefinic) may be unstable.

[0186] A “pharmaceutical composition” refers to a mixture of one or more of the compounds described in the present invention or physiologically / pharmaceutically acceptable salts or prodrugs thereof and other chemical components such as physiologically / pharmaceutically acceptable carriers and excipients. The purpose of a pharmaceutical composition is to facilitate administration of a compound to an organism, which is conducive to the absorption of the active ingredient and thus displaying biological activity.

[0187] The present invention is intended to include all stereoisomers occurring in the present compounds. The term “stereoisomers” refers to isomers that are structurally identical but differ in the arrangement of the atoms in space. It includes cis and trans (or Z and E) isomers, (-) -and (+) -isomers, (R) -and (k) -cnantiomcrs, diastereomers, (D) -and (L) -isomers, tautomers, atropisomers, conformers, and mixtures thereof (e.g., mixtures of racemates and diastereomers) . Additional asymmetric atoms may be present in the substituents in the compounds of the present disclosure. All such stereoisomers and mixtures thereof are included within the scope of the present disclosure. Optically active (-) -and (+) -isomers, (R) -and (k) -cnantiomcrs, and (D) -and (L) -isomers can be prepared by chiral synthesis, chiral reagents, or other conventional techniques. One isomer of a certain compound of the present disclosure may be prepared by asymmetric synthesis or with a chiral auxiliary, or, when the molecule contains a basic functional group (e.g., amino) or an acidic functional group (e.g., carboxyl) , a diastereomeric salt is formed with an appropriate optically active acid or base, followed by diastereomeric resolution by conventional methods known in the art to give the pure isomer. In addition, separation of enantiomers and diastereomers is generally accomplished by chromatography.

[0188] The present invention is intended to include all isotopes of atoms occurring in the present compounds. Isotopes include those atoms having the same atomic number but different mass numbers. By way of general example and without limitation, isotopes of hydrogen include deuterium and tritium. Isotopes of carbon include13C and14C. Isotopically-labeled compounds of the invention can generally be prepared by conventional techniques known to those skilled in the art or by processes analogous to those described herein, using an appropriate isotopically-labeled reagent in place of the non-labeled reagent otherwise employed. Prodrugs and solvates of the inventive compounds are also contemplated.

[0189] The term "prodrug" denotes a compound which, upon administration to a subject, undergoes chemical conversion by metabolic or chemical processes to yield a compound of the formula I, and / or a salt and / or solvate thereof. Any compound that will be converted in vivo to provide the bioactive agent (i.e., the compound for formula I) is a prodrug within the scope and spirit of the invention. For example, compounds containing a carboxy group can form physiologically hydrolyzable esters which serve as prodrugs by being hydrolyzed in the body to yield formula I compounds per se. Such prodrugs are preferably administered orally since hydrolysis in many instances occurs principally under the influence of the digestive enzymes. Parenteral administration may be used where the ester per se is active, or in those instances where hydrolysis occurs in the blood.

[0190] “Pharmaceutically acceptable salts” refer to salts of the compounds of the invention, such salts being safe and effective when used in a mammal and have corresponding biological activity.

[0191] In the chemical formula, the abbreviation “Me” refers to methyl.

[0192] The present disclosure also comprises the compounds of formula (a) or formula (b) in various deuterated forms. Each of the available hydrogen atoms attached to the carbon atom can be independently replaced by a deuterium atom. Those skilled in the art can synthesize a compound of formula formula (a) or formula (b) in a deuterated form with reference to the relevant literatures. The compound of formula formula (a) or formula (b) in deuterated form can be prepared by employing commercially available deuterated raw materials, or they can be synthesized by conventional techniques with deuterated reagents including, but not limited to, deuterated borane, trideuterated borane in tetrahydrofuran, deuterated lithium aluminum hydride, deuterated iodoethane, deuterated iodomethane and the like.

[0193] The term “excipient” is an adjunct in a pharmaceutical formulation other than a main drug, which can also be referred to as an adjuvant, such as adhesives, fillers, disintegrants, lubricants in tablets; matrix parts in the semi-solid preparations ointment and cream; preservatives, antioxidants, flavoring agents, fragrances, co-solvents, emulsifiers, solubilizers, osmotic pressure regulators, colorants in liquid preparations and the like.

[0194] The term “diluent” , also known as filler, is primarily intended to increase the weight and volume of the tablet. The addition of diluent ensures a certain volume, reduces the dose deviation of the main components, and improves the compression profile of the drug. When the tablet contains an oily component, an absorbent is added to absorb the oily substance, thereby keeping the “dry” state to facilitate tablet formation. For example, diluent includes starch, lactose, inorganic salts of calcium, microcrystalline cellulose and the like.

[0195] The term “solvate” refers to a pharmaceutically acceptable solvate formed by a ligand-drug conjugate of the present disclosure with one or more solvent molecule (s) . Non-limiting examples of solvent molecules include water, ethanol, acetonitrile, isopropanol, DMSO, ethyl acetate.

[0196] The present disclosure will be further described with reference to the following examples, but the examples should not be considered as limiting the scope of the present disclosure.

[0197] The experimental methods in the examples of the present disclosure for which the specific conditions are not indicated were carried out according to conventional conditions or the conditions recommended by the material or product manufacturers. The reagents for which the specific sources are not indicated are conventional reagents purchased from market.

[0198] SYNTHESIS PROCEDURES

[0199] Mehod A: preparation of compounds

[0200] Method A1: Synthesis of C1

[0201] (S) -2-amino-3-azido-N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) propenamide

[0202] To a solution of (2S) -3-azido-2-Boc-propanoic acid (23 mg, 0.1 mmol) , exetecan mesylate (44 mg, 0.1 mmol) in DMF (2 mL) was added DIEA (20 uL) followed by PYAOP (53 mg, 0.1 mmol) . After 5min, reverse phase HPLC of the mixture gave the Boc-compound as a yellow solid (40 mg) . MS (m / z) : 648.2 [M+H] +.

[0203] The above Boc-compound (22 mg) was dissolved in DCM (2 mL) , TFA (0.3 mL) was added dropwise. After 1h, the mixture was concentrated under vacuum to give a residue which was purified by reverse prep HPLC to give the title C1 as a TFA salt (13 mg) . MS (m / z) : 548.2 [M+H] +. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.02 (d, J = 8 Hz, 1H) , 8.42 (s, 2H) , 7.86 (d, J = 12 Hz, 1H) , 7.33 (s, 1H) , 6.55 (s, 1H) , 5.64 –5.63 (m, 1H) , 5.44 (s, 2H) , 5.38 –5.33 (m, 1H) , 5.16 –5.12 (m, 1H) , 4.06 –4.01 (m, 2H) , 3.79-3.77 (m, 1H) , 3.65-3.60 (m, 1H) , 3.21-3.15 (m, 1H) , 2.44 (s, 3H) , 2.28-2.21 (m, 1H) , 2.19-2.08 (m, 1H) , 1.88-1.80. (m, 2H) , 0.88 (t, J = 8 Hz, 3H) .

[0204] Method A2: Synthesis of C2

[0205] (R) -3-azido-N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -2-hydroxypropanamide

[0206] Step 1: Synthesis of methyl (R) -3-azido-2-hydroxypropanoate A mixture of methyl (R) -oxirane-2-carboxylate (1.0 g, 9.80 mmol, 1.0 equiv. ) , sodium azide (1.91 g, 29.41 mmol, 3.0 equiv. ) and ammonium chloride (786 mg, 14.7 mmol, 1.5 equiv. ) in MeOH (20 mL) and water (1 mL) was stirred at 65 ℃ for 2 h. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure and the residue was extracted with EtOAc, dried over Na2SO4, filtered, and concentrated in vacuo to afford methyl (R) -3-azido-2-hydroxypropanoate 2 (1.1g, 77.4%) as yellow oil. The crude product was directly used for the next step without further purification.

[0207] Step 2: Synthesis of (R) -3-azido-2-hydroxypropanoic acid A mixture of (R) -3-azido-2-hydroxypropanoate 2 (300 mg, 2.07 mmol, 1.0 equiv. ) and lithium hydroxide monohydrate (104 mg, 2.48 mmol, 1.2 equiv. ) in THF (3 mL) and water (1 mL) was stirred at room temperature for 1 h. After completion, the reaction mixture was adjusted to pH 3 ～ 5 with 1 M HCl solution. Then the reaction mixture was extracted with EtOAc, dried over Na2SO4, filtered, and concentrated in vacuo to afford (R) -3-azido-2-hydroxypropanoic acid 3 (200 mg, 73.7%) as yellow oil. The crude product was directly used for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : 130.05 [M-H] -.

[0208] Step 3: Synthesis of C2 A mixture of Exatecan mesylate (200 mg, 0.376 mmol, 1.0 equiv. ) , (R) -3-azido-2-hydroxypropanoic acid (59 mg, 0.451 mmol, 1.2 equiv. ) , HATU (171 mg, 0.451mmol, 1.2 equiv. ) and DIEA (194 mg, 1.50 mmol, 4.0 equiv. ) in DMF (4 mL) was stirred at room temperature for 1 h. The reaction mixture was purified by Prep-HPLC to afford C2 (51 mg, 24.7%) as yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : 549.20 [M+H] +

[0209] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.67 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.78 (d, J = 10.8 Hz, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 6.54 (s, 1H) , 6.26 (d, J = 5.6 Hz, 1H) , 5.57 (s, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.21-5.18 (m, 2H) , 4.28-4.24 (m, 1H) , 3.60-3.56 (m, 2H) , 3.21-3.15 (m, 2H) , 2.39 (s, 3H) , 2.21-2.15 (m, 2H) , 1.90-1.84 (m, 2H) , 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0210] Method A3: Synthesis of C5

[0211] (R) -N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -2-hydroxy-3- (1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) propanamide

[0212] Step 1: Synthesis of methyl (R) -2-hydroxy-3- (1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) propanoate

[0213] A mixture of methyl methyl (R) -3-azido-2-hydroxypropanoate (200 mg, 1.379 mmol, 1.0 equiv. ) , ethynyltrimethylsilane (163 mg, 1.655 mmol, 1.2 equiv. ) , copper (II) sulfate (44.2 mg, 0.276 mmol, 0.2 equiv. ) and sodium ascorbate (300 mg, 1.517 mmol, 1.1 equiv. ) in tBuOH (4 mL) and water (4 mL) was stirred at room temperature for 16 h. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure and the residue was extracted with EtOAc, dried over Na2SO4, filtered, purified by column chromatography on silica gel to afford (R) -2-hydroxy-3- (1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) propanoate (170 mg, 72.09%) as a colourless oil. The crude product was directly used for the next step without further purification.

[0214] Step 2: Synthesis of (R) -2-hydroxy-3- (1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) propanoic acid

[0215] A mixture of methyl (R) -2-hydroxy-3- (1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) propanoate (70 mg, 0.41 mmol, 1.0 equiv. ) and lithium hydroxide monohydrate (21 mg, 0.49 mmol, 1.2 equiv. ) in THF (2 mL) and water (0.7 mL) was stirred at room temperature for 1 h. After completion, the reaction mixture was adjusted to pH 3 ～ 5 with 1M HCl solution. Then the reaction mixture was concentrated in vacuo to afford (R) -3-azido-2-hydroxypropanoic acid (crude 90 mg) . The crude product was directly used for the next step without further purification.

[0216] Step 3: A mixture of Exatecan mesylate (170 mg, 0.32 mmol, 1.0 equiv. ) , (R) -2-hydroxy-3-(1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) propanoic acid (60.3 mg, 0.38 mmol, 1.2 equiv. ) , HATU (144.5 mg, 0.38 mmol, 1.2 equiv. ) and DIEA (165 mg, 1.28 mmol, 4.0 equiv. ) in DMF (4 mL) was stirred at room temperature for 1 h. The reaction mixture was purified by Prep-HPLC to afford C5 (65 mg, 35.3%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : 575.26 [M+H] +.

[0217] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.69 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 8.07 (d, J = 0.8 Hz, 1H) , 7.80 (d, J = 11.0 Hz, 1H) , 7.71 (d, J = 0.6 Hz, 1H) , 7.32 (s, 1H) , 6.55 (s, 1H) , 6.19 (s, 1H) , 5.58 (t, J = 9.8 Hz, 1H) , 5.44 (s, 2H) , 5.24 (q, J = 18.8 Hz, 2H) , 4.80 (dd, J = 13.9, 3.8 Hz, 1H) , 4.67 (dd, J = 13.8, 8.2 Hz, 1H) , 4.45 (dd, J = 8.2, 3.6 Hz, 1H) , 3.16 (s, 2H) , 2.40 (s, 3H) , 2.17 (ddd, J = 24.4, 12.8, 6.0 Hz, 2H) , 1.87 (qd, J = 14.0, 7.2 Hz, 2H) , 0.88 (t, J = 7.4 Hz, 4H) .

[0218] Method A4: Synthesis of C11

[0219] Step 1: To a solution of (1S, 9S) -1-amino-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-1, 2, 3, 9, 12, 15-hexahydro-10H, 13H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13-dione (C11-1) (1 g, 1.88 mmol, MS) and (2R) -3-azido-2- (tert-butoxycarbonylamino) propanoic acid (C11-2) (476.42 mg, 2.07 mmol) in DMF (24.00 mL) was added DIEA (972.55 mg, 7.53 mmol, 1.31 mL) at 0℃, then the reaction mixture was added HATU (922.68 mg, 2.45 mmol) at 0℃ and stirred at 0℃ for 1 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC (TFA) to afford tert-butyl ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) carbamate compound 2 (0.935 g, 1.44 mmol, 76.74%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : 648.21 [M+H] +.

[0220] Step 2: To a solution of tert-butyl ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) carbamate compound 2 (600 mg, 926.42 μmol) in DCM (18.00 mL) was added trifluoroacetic acid (105.63 mg, 926.42 μmol, 1.8 mL) . Then the mixture was stirred at 20 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure and purified by Prep-HPLC (TFA) to afford (R) -2-amino-3-azido-N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) propanamide C11 (500 mg, 81.71%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : 548.13 [M+H] +

[0221] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.02 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 8.38 (s, 2H) , 7.86 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.34 (s, 1H) , 6.57 (s, 1H) , 5.72 –5.60 (m, 1H) , 5.46 –5.21 (m, 4H) , 3.95 (t, J = 5.1 Hz, 1H) , 3.80 (d, J = 5.1 Hz, 2H) , 3.31-3.26 (m, 1H) , 3.15-3.08 (m, 1H) , 2.44 (s, 3H) , 2.28-2.24 (m, 1H) , 2.14-2.09 (m, 1H) , 1.90-1.85 (m, 2H) , 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0222] Method A5: Synthesis of C31

[0223] Step 1: To a stirred solution of C31-1 (2 g, 22.96 mmol) in EtOH (30 mL) was added C31-2 (3.05 g, 29.84 mmol) , then the reaction mixture was stirred at 70℃ for 1 h. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure to afford the crude product methyl 2-hydroxy-3-morpholino-propanoate C31-3 (4.3 g) as colorless oil. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 190.13.

[0224] Step 2: To a stirred solution of methyl 2-hydroxy-3-morpholino-propanoate C31-3 (4.2 g, 22.20 mmol) in THF (40 mL) and water (10 mL) was added LiOH·H2O (1.07 g, 26.64 mmol) , then the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 2 h. After completion, the reaction mixture was added with 1M HCl to adjust pH to 3. Then the mixture was concentrated under reduced pressure to afford the crude product 2-hydroxy-3-morpholino-propanoic acid C31-4 (4 g) as colorless oil. The crude product was used directly for the next step without further purification LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 176.11

[0225] Step 3: To a stirred solution of (1S, 9S) -1-amino-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-1, 2, 3, 9, 12, 15-hexahydro-10H, 13H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13-dione exatecan (500 mg, 1.15 mmol) , 2-hydroxy-3-morpholino-propanoic acid C31-4 (486.04 mg, 2.30 mmol, CL) and DIEA (890.42 mg, 6.89 mmol, 1.20 mL) in DMF (15 mL) was added HATU (866.40 mg, 2.30 mmol) . The reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h. After completion, the reaction mixture was purified by Prep-HPLC to give the desired product N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -2-hydroxy-3-morpholinopropanamide C31 (224.4 mg, 32.98%yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 593.24.

[0226] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.85 (s, 1H) , 8.83-8.79 (m, 1H) , 7.86-7.80 (m, 1H) , 7.33 (s, 1H) , 6.76 –6.39 (m, 2H) , 5.67 –5.53 (m, 1H) , 5.44 (s, 2H) , 5.29 –5.10 (m, 2H) , 4.57-4.53 (m, 1H) , 4.09-3.00 (m, 11H) , 2.41 (s, 3H) , 2.28 –2.13 (m, 2H) , 1.94 –1.80 (m, 2H) , 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0227] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0228] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0229] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0230] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0231] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0232] 2.6-3.5 min: 5%B

[0233] Flow rate: 1 mL / min

[0234] Column temperature: 25℃

[0235] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0236] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0237] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0238] Flow rate: 35 mL / min

[0239] Column temperature: 25℃

[0240] Method A6: Synthesis of C110

[0241] Step 1: To a solution of 4, 4-dimethylpiperidine (222 mg, 1.96 mmol) in EtOH (20 mL) was added methyl oxirane-2-carboxylate C110-1 (200 mg, 1.96 mmol) . Then the reaction mixture was stirred at 70℃ for 1 h. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure and purified by silica gel column chromatography with petroleum ether and EtOAc (20: 1) to afford methyl 3- (4, 4-dimethylpiperidin-1-yl) -2-hydroxypropanoate C110-2 (241 mg, 57%yield) as a colorless oil. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 216.09.

[0242] Step 2: To a solution of methyl 3- (4, 4-dimethylpiperidin-1-yl) -2-hydroxypropanoate C110-2 (230 mg, 1.07 mmol) in THF (3 mL) and H2O (1 mL) was added LiOH (76.76 mg, 3.21 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure to afford 3- (4, 4-dimethylpiperidin-1-yl) -2-hydroxypropanoic acid C110-3 (290 mg) as a crude product. The crude product was directly used for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 202.21.

[0243] Step 3: To a mixure of 3- (4, 4-dimethylpiperidin-1-yl) -2-hydroxypropanoic acid C110-3 (260 mg, 1.29 mmol) , exatecan (187.5 mg, 430.62 μmol) and DIEA (111.31 mg, 861.23 μmol) in DMF (5 mL) was added HATU (487.38 mg, 1.29 mmol) . Then the reaction mixture was stirred at room temperature for 3 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC to afford C110 (196 mg, 73 %yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 619.22.

[0244] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.14-9.12 (m, 1H) , 8.87-8.75 (m, 1H) , 7.81 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 7.33 (s, 1H) , 5.63-5.58 (m, 1H) , 5.44 (s, 2H) , 5.26-5.22 (m, 2H) , 4.61-4.55 (m, 1H) , 3.45-3.33 (m, 4H) , 3.22-3.07 (m, 4H) , 2.43 (s, 3H) , 2.27-2.14 (m, 2H) , 1.91-1.84 (m, 2H) , 1.63-1.46 (m, 4H) , 1.04-1.00 (m, 3H) , 0.98-0.95 (m, 3H) , 0.88 (t, J = 6.0 Hz, 3H) .

[0245] Method A7: Synthesis of C115

[0246] Step 1: To a solution of morpholine C115-1 (500 mg, 5.74 mmol) in MeOH (20 mL) was added. methyl (R) -oxirane-2-carboxylate C115-1a (586 mg, 5.74 mmol) . Then the mixture was stirred at 70 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure to afford methyl (R) -2-hydroxy-3-morpholinopropanoate C115-2 (1.026 g) as a colorless oil. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 190.18.

[0247] Step 2: To a solution of methyl (R) -2-hydroxy-3-morpholinopropanoate C115-2 (1.026 g, 5.42 mmol) in THF (10 mL) and H2O (3 mL) was added LiOH·H2O (240 mg, 5.69 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion, the reaction mixture was added with 1 M HCl to adjust pH = 3. Then the mixture was concentrated under reduced pressure to afford (R) -2-hydroxy-3-morpholinopropanoic acid C115-3 (1.1 g) as a white solid. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] +found, 176.11.

[0248] Step 3: To a solution of (R) -2-hydroxy-3-morpholinopropanoic acid C115-3 (70 mg, 624 μmol) , exatecan mesylate (255 mg, 480 μmol) , DIEA (247 mg, 1.92 mmol) in DMF (5 mL) was added HATU (183 mg, 480 μmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC to afford C115 (160 mg, 55.9 %) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 593.18.

[0249] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.88 (s, 1H) , 8.86 (d, J = 9.0 Hz, 1H) , 7.77 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.32 (s, 1H) , 6.70 (s, 1H) , 6.57 (s, 1H) , 5.63-5.57 (m, 1H) , 5.42 (s, 2H) , 5.27 –5.00 (m, 2H) , 4.62-4.56 (m, 1H) , 4.15 –3.00 (m, 11H) , 2.38 (d, J = 1.8 Hz, 3H) , 2.24 –2.14 (m, 2H) , 1.88-1.84 (m, 2H) , 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0250] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0251] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0252] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0253] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0254] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0255] 2.6-3.5 min: 5%B

[0256] Flow rate: 1 mL / min

[0257] Column temperature: 25℃

[0258] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0259] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0260] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0261] Flow rate: 35 mL / min

[0262] Column temperature: 25℃

[0263] Method A8: Synthesis of C116

[0264] Step 1: To a solution of morpholine C116-1 (1 g, 9.80 mmol) in EtOH (20 mL) was added methyl (S) -oxirane-2-carboxylate C116-1a (784.60 mg, 8.90 mmol) . Then the mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure to afford methyl (S) -2-hydroxy-3-morpholinopropanoate C116-2 (800 mg, crude) as a white solid. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 190.18.

[0265] Step 2: To a solution of methyl (S) -2-hydroxy-3-morpholinopropanoate C116-2 (200 mg, 1.06 mmol) in THF (3 mL) and H2O (1 mL) was added LiOH·H2O (75.95 mg, 3.17 mmol) . Then the mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure to afford (S) -2-hydroxy-3-morpholinopropanoic acid C116-3 (163 mg) as a crude product. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 176.11.

[0266] Step 3: To a solution of (S) -2-hydroxy-3-morpholinopropanoic acid C116-3 (65 mg, 374.33 μmol) , exatecan (163 mg, 374.33 μmol) and DIEA (58.05 mg, 449.20 μmol) in DMF (20 mL) was added HATU (282.45 mg, 748.66 μmol) . Then the mixture was stirred at room temperature for 3 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC to afford C116 (40 mg, 18 %) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 593.18.

[0267] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.86 (s, 1H) , 8.75 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 7.75 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 7.33 (s, 1H) , 6.56 (s, 1H) , 6.48 (s, 1H) , 5.61-5.58 (m, 1H) , 5.44 (s, 2H) , 5.28-5.17 (m, 2H) , 4.53 (s, 1H) , 4.00-3.05 (m, 11H) , 2.42 (s, 3H) , 2.28-2.14 (m, 2H) , 1.93-1.86 (m, 2H) , 0.88 (t, J =6.0 Hz, 3H) .

[0268] Method A9: Synthesis of C127

[0269] Step 1: To a stirred solution of potassium (R) -oxirane-2-carboxylate C127-1 (4 g, 31.71 mmol) and bromomethylbenzene (6.51 g, 38.05 mmol) in MeCN (100 mL) was added 18-crown-6 (1.26 g, 4.76 mmol) . Then the reaction mixture was stirred at 40 ℃ for 12 h. After completion, the mixture was concentrated and purified by FCC (15%EtOAc in petroleum ether) to give benzyl (R) -oxirane-2-carboxylate C127-2 (2.7 g, 15.15 mmol, 47.8%yield) as colorless oil.

[0270] Step 2: A mixture of 4, 4-dimethylpiperidine (0.2 g, 1.77 mmol) and benzyl (2R) -oxirane-2-carboxylate C127-2 (346.29 mg, 1.94 mmol) in 1, 4-dioxane (2 mL) was stirred at 60 ℃ for 16 h. After completion, the mixture was concentrated and purified by FCC (18%EtOAc in petroleum ehter) to give benzyl (2R) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2-hydroxy-propanoate) C127-3 (0.2 g, 686.38 μmol, 38.9%) as yellow oil. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 292.20

[0271] Step 3: A mixture of benzyl (2R) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2-hydroxy-propanoate C127-3 (0.1 g, 343.19 μmol) in DMF (1 mL) was added Pd / C (10 mg, 82.34 μmol, 10%purity) under N2 atmosphere. Degassed and then refilled with H2 over 3 times. The reaction mixture was stirred at 20 ℃ for 1 h under H2 balloon. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure to give (2R) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2-hydroxy-propanoic acid C127-4 (69.07 mg, 343.18 μmol, 100.00%yield) as a crude product. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 202.20

[0272] Step 4: To a stirred solution of exatecan (151.86 mg, 285.70 μmol, MS) and (2R) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2-hydroxy-propanoic acid C127-4 (69 mg, 342.84 μmol) in DMF (1 mL) was added DIEA (110.77 mg, 857.09 μmol, 149.29 μL) , HATU (129.34 mg, 342.84 μmol) and the reaction mixture was stirred at 20℃ for 1.5 h. After completion, the mixture was purified by prep-HPLC to give (R) -3- (4, 4-dimethylpiperidin-1-yl) -N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -2-hydroxypropanamide C127 (30 mg, 49.48 μmol, 16.97 yield) as a light-yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 619.23

[0273] 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.85 (d, J = 9.1 Hz, 1H) , 7.75 (d, J = 10.8 Hz, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 6.68 –6.60 (m, 2H) , 5.64 –5.57 (m, 1H) , 5.41 (s, 2H) , 5.24 –5.18 (m, 1H) , 5.10 –5.02 (m, 1H) , 4.63 –4.58 (m, 1H) , 3.68 –3.60 (m, 1H) , 3.27 –3.05 (m, 5H) , 2.40 –2.36 (m, 3H) , 2.22 –2.16 (m, 2H) , 1.89 –1.85 (m, 2H) , 1.78 –1.70 (m, 1H) , 1.68 –1.60 (m, 1H) , 1.58 –1.50 (m, 2H) , 1.23 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 1.02 –0.97 (m, 7H) , 0.86 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0274] Method A10: Synthesis of C128

[0275] Step 1: To a stirred solution of [ (2S) -oxirane-2-carbonyl] oxypotassium C128-1 (4 g, 31.71 mmol) and bromomethylbenzene (6.51 g, 38.05 mmol) in MeCN (100 mL) was added 18-crown-6 (1.26 g, 4.76 mmol) . Then the reaction mixture was stirred at 40 ℃ for 12 h. After completion, the mixture was concentrated and purified by FCC (15%EtOAc in petroleum ether) to give benzyl (2S) -oxirane-2-carboxylate C128-2 (2.7 g, 15.15 mmol, 47.79%yield) as colorless oil.

[0276] Step 2: A mixture of 4, 4-dimethylpiperidine (300 mg, 2.65 mmol) and benzyl (2S) -oxirane-2-carboxylate C128-2 (519.44 mg, 2.92 mmol) in 1, 4-dioxane (10 mL) was stirred at 100 ℃ for 12 h. After completion, the mixture was concentrated and purified by FCC (18%EtOAc in petroleum ehter) to give benzyl (2S) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2-hydroxy-propanoate C128-3 (515 mg, 1.77 mmol, 66.69%yield) as yellow oil. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 292.20

[0277] Step 3: A mixture of benzyl (2S) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2-hydroxy-propanoate C128-3 (515 mg, 1.77 mmol) in DMF (5 mL) was added Pd / C (188.09 mg, 176.74 μmol, 10%purity) under N2 atmosphere. Degassed and then refilled with H2 over 3 times. The reaction mixture was stirred at 20 ℃ for 2 h under H2 balloon. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure to give (2S) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2-hydroxy-propanoic acid C128-4 (350 mg, crude) as a crude product. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 202.20

[0278] Step 4: To a stirred solution of exatecan (750 mg, 1.41 mmol, MS) and (2S) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2-hydroxy-propanoic acid C128-4 (340.77 mg, 1.69 mmol) in DMF (8.51 mL) was added DIEA (547.07 mg, 4.23 mmol, 737.29 μL) and HATU (798.47 mg, 2.12 mmol) , and the reaction mixture was stirred at 20℃ for 1 h. After completion, the mixture was purified by prep-HPLC to give (S) -3- (4, 4-dimethylpiperidin-1-yl) -N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -2-hydroxypropanamide C-128 (174.5 mg, 282.05 μmol, 20%yield) as a light-yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 619.23

[0279] 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.52 (d, J = 9.0 Hz, 1H) , 8.17 (s, 1H) , 7.80 (d, J = 10.8 Hz, 1H) , 7.30 (s, 1H) , 6.53 (s, 1H) , 5.70 –5.61 (m, 1H) , 5.41 (q, J = 16.2 Hz, 2H) , 5.32 –5.22 (m, 2H) , 4.03 (dd, J = 7.8, 5.4 Hz, 1H) , 3.24 –3.16 (m, 3H) , 2.66 –2.61 (m, 1H) , 2.41 (s, 3H) , 2.33 –2.25 (m, 3H) , 2.22 –2.17 (m, 1H) , 2.17 –2.08 (m, 3H) , 1.87 –1.78 (m, 2H) , 0.86 (t, J = 7.2 Hz, 3H) , 0.84 –0.79 (m, 2H) , 0.75 –0.69 (m, 2H) , 0.60 (s, 6H) .

[0280] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0281] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0282] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0283] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0284] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0285] 2.6-3.5 min: 5%B

[0286] Flow rate: 1 mL / min

[0287] Column temperature: 25 oC

[0288] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0289] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0290] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0291] Flow rate: 35 mL / min

[0292] Column temperature: 25℃

[0293] Method A11: Synthesis of C24

[0294] Step 1: To a solution of 1H-pyrazole (222 mg, 1.96 mmol) in EtOH (20 mL) was added methyl (R) -oxirane-2-carboxylate C24-1 (200 mg, 1.96 mmol) . Then the reaction mixture was stirred at 70℃ for 1 h. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure and purified by silica gel column chromatography with petroleum ether and EtOAc (20: 1) to afford methyl (R) -2-hydroxy-3- (1H-pyrazol-1-yl) propanoate C24-2 (241 mg, 57%yield) as a colorless oil. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 171.03.

[0295] Step 2: To a solution of methyl (R) -2-hydroxy-3- (1H-pyrazol-1-yl) propanoate C24-2 (230 mg, 1.07 mmol) in THF (3 mL) and H2O (1 mL) was added LiOH (76.76 mg, 3.21 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure to afford (R) -2-hydroxy-3- (1H-pyrazol-1-yl) propanoic acid C24-3 (290 mg) as a crude product. The crude product was directly used for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 157.05.

[0296] Step 3: To a mixure of (R) -2-hydroxy-3- (1H-pyrazol-1-yl) propanoic acid C24-3 (260 mg, 1.29 mmol) , C24-4 (187.5 mg, 430.62 μmol) and DIEA (111.31 mg, 861.23 μmol) in DMF (5 mL) was added HATU (487.38 mg, 1.29 mmol) . Then the reaction mixture was stirred at room temperature for 3 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC to afford C24 (196 mg, 73 %yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 574.19.

[0297] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.58 (d, J = 9.0 Hz, 1H) , 7.77 (d, J = 11.0 Hz, 1H) , 7.66 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 7.37 (d, J = 1.4 Hz, 1H) , 7.32 (s, 1H) , 6.54 (s, 1H) , 6.19 (t, J = 2.0 Hz, 1H) , 6.03 (s, 1H) , 5.59 (dd, J = 13.5, 6.6 Hz, 1H) , 5.45 (s, 2H) , 5.30 (d, J = 18.8 Hz, 1H) , 5.15 (d, J =18.8 Hz, 1H) , 4.57 –4.33 (m, 3H) , 3.15 (s, 2H) , 2.39 (s, 3H) , 2.24 –2.09 (m, 2H) , 1.94 –1.82 (m, 2H) , 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0298] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0299] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0300] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0301] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0302] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0303] 2.6-3.5 min: 5%B

[0304] Flow rate: 1 mL / min

[0305] Column temperature: 25℃

[0306] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0307] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0308] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0309] Flow rate: 35 mL / min

[0310] Column temperature: 25℃

[0311] Method A12: Synthesis of C27

[0312] Step 1: To a solution of potassium cyanide (1.3 g, 19.6 mmol) in ACN (100 mL) and H2O (10 mL) was added methyl (R) -oxirane-2-carboxylate C27-1 (1 g, 9.8 mmol) and Cerium (Ⅲ) chloride heptahydrate (1.3 g, 5.88 mmol) . The mixture was stirred at rt for 3 h, then increased the temperature to 80 C and reacted 1.5 h. After completion, the mixture was extracted with EA, dried over Na2SO4, filtered, and concentrated in vacuo, purified by column chromatography on silica gel to afford methyl (S) -3-cyano-2-hydroxypropanoate C27-2 (100 mg) as colurless oil.

[0313] Step 2: To a solution of methyl (S) -3-cyano-2-hydroxypropanoate C27-2 (100 mg, 0.775 mmol) in THF (1 mL) and H2O (0.4 mL) was added LiOH-H2O (36 mg, 0.852 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion, the pH value of the reaction mixture was adjusted to 1～3 by 1M hydrochloric. The mixture was concentrated under reduced pressure to afford (S) -3-cyano-2-hydroxypropanoic acid C27-3 (120 mg, crude) as a white solid. The crude product was directly used for the next step without further purification.

[0314] Step 3: To a solution of (S) -3-cyano-2-hydroxypropanoic acid C27-3 (60 mg, crude, 0.388m mol) , Exatecan mesylate (206 mg, 0.388 μmol) , DIEA (200 mg, 1.55 mmol) in DMF (5 mL) was added HATU (177 mg, 0.466 mol) . The mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC to afford (S) -3-cyano-N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -2-hydroxypropanamide EXT-CN (S) (79 mg, 38.2 %) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 533.23.

[0315] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.66 (d, J=12, 1H) , 7.78 (d, J=12, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 6.39 –6.56 (m, 2H) , 5.53 -5.57 (m, 1H) , 5.42 (s, 2H) , 5.18 –5.23 (m, 2H) , 4.31 –4.33 (m, 1H) , 3.16 –3.18 (m, 2H) , 2.88 –2.89 (m, 2H) , 2.39 (s, 1H) , 2.14 –2.23 (m, 2H) , 1.84 –1.88 (m, 2H) , 0.85 –0.89 (t, J=7.6, 3H)

[0316] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0317] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0318] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0319] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0320] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0321] 2.6-3.5 min: 5%B

[0322] Flow rate: 1 mL / min

[0323] Column temperature: 25℃

[0324] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0325] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0326] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0327] Flow rate: 35 mL / min

[0328] Column temperature: 25℃

[0329] Method A13: Synthesis of C70

[0330] Step 1: To a stirred solution of methyl (2R) -oxirane-2-carboxylate C70-1 (200 mg, 1.96 mmol) in EtOH (3 mL) was added pyrrolidine C70-2 (139.33 mg, 1.96 mmol) , and the reaction mixture was heated to reflux for 1 h. After completion, The mixture was concentrated to give methyl (2R) -2-hydroxy-3-pyrrolidin-1-yl-propanoate C70-3 (300 mg, crude) as crude product. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 174.20

[0331] Step 2: To a stirred solution of methyl (2R) -2-hydroxy-3-pyrrolidin-1-yl-propanoate C70-3 (300 mg, 1.73 mmol) in THF (3 mL) and Water (1 mL) was added LiOH (124.44 mg, 5.20 mmol) and the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h. After completion, H2O (20 mL) was added to the reaction mixture, then the mixture was extracted with DCM (10 mL*3) , the aqueous phase was adjusted pH=2～3 with 1N HCl. The acidate aqueous phase was under lyophilization to give (2R) -2-hydroxy-3-pyrrolidin-1-yl-propanoic acid C70-4 (200 mg, crude) as light-yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 164.10

[0332] Step 3: To a stirred solution of (1S, 9S) -1-amino-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-1, 2, 3, 9, 12, 15-hexahydro-10H, 13H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13-dione EXT (200 mg, 459.30 μmol) , (2R) -2-hydroxy-3-pyrrolidin-1-yl-propanoic acid C70-4 (109.67 mg, 688.95 μmol) and DIEA (178.08 mg, 1.38 mmol, 240.00 μL) in DMF (2 mL) was added HATU (207.93 mg, 551.16 μmol) and the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was purified by prep-HPLC to give N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -2-hydroxy-3- (pyrrolidin-1-yl) propanamide C70 (88 mg, 152.62 μmol, 33.23%yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 577.31

[0333] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.46 (d, J = 9.0 Hz, 1H) , 7.78 (d, J = 11.0 Hz, 1H) , 7.30 (s, 1H) , 6.52 (s, 1H) , 5.67 –5.52 (m, 1H) , 5.42 (s, 2H) , 5.38 –5.13 (m, 2H) , 4.13 (dd, J = 7.8, 5.4 Hz, 1H) , 3.44 –3.14 (m, 5H) , 2.87 –2.84 (m, 1H) , 2.78 –2.76 (m, 1H) , 2.53 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.39 (s, 3H) , 2.25 –2.06 (m, 2H) , 1.90 –1.81 (m, 2H) , 1.69 –1.41 (m, 4H) , 0.85 (t, 3H) .

[0334] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0335] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0336] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0337] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0338] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0339] 2.6-3.5 min: 5%B

[0340] Flow rate: 1 mL / min

[0341] Column temperature: 25℃

[0342] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0343] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0344] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0345] Flow rate: 35 mL / min

[0346] Column temperature: 25℃

[0347] Method A14: Synthesis of C72

[0348] Step 1: To a solution of sodium azide (1.95 g, 30 mmol) and ammonium chloridein (802 mg, 15 mmol) in MeOH (20 mL) and H2O (1mL) was added methyl (R) -oxirane-2-carboxylate C72-1 (1 g, 10 mmol) . Then the mixture was stirred at 70C for 2 h. After completion, the mixture was extracted with EA, dried over Na2SO4, filtered, and concentrated in vacuo to afford methyl (S) -3-azido-2-hydroxypropanoate (1g) C72-2 as colurless oil.

[0349] LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 146.12.

[0350] Step 2: To a solution of methyl (S) -3-azido-2-hydroxypropanoate C72-2 (100 mg, 0.69 mmol) in THF (2 mL) and H2O (0.5 mL) was added LiOH-H2O (35 mg, 0.83 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion, the pH value of the reaction mixture was adjusted to 1～3 by 1M hydrochloric. The mixture was concentrated under reduced pressure to afford (S) -3-azido-2-hydroxypropanoic acid C72-3 (70 mg) as a white solid. The crude product was directly used for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 132.15.

[0351] Step 3: To a solution of (S) -3-azido-2-hydroxypropanoic acid C72-3 (50 mg, 382 μmol) , Exatecan mesylate (223 mg, 420 μmol) , DIEA (200 mg, 1.53 mmol) in DMF (5 mL) was added HATU (160 mg, 420 μmol) . The mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC to afford (S) -3-azido-N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -2-hydroxypropanamide C72 (83 mg, 39.7 %) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 549.23.

[0352] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.61 (d, J=8.4, 1H) , 7.78 (d, J=11.2, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 6.15 (d, J=5.6, 1H) , 5.52 -5.54 (m, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.20 –5.22 (m, 2H) , 4.24 –4.27 (m, 1H) , 3.49 –3.50 (m, 2H) , 3.14 –3.19 (m, 2H) , 2.40 (s, 1H) , 2.12 –2.26 (m, 2H) , 1.83 –1.90 (m, 2H) , 0.85 –0.89 (t, J=7.6, 3H)

[0353] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0354] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0355] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0356] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0357] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0358] 2.6-3.5 min: 5%B

[0359] Flow rate: 1 mL / min

[0360] Column temperature: 25℃

[0361] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0362] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0363] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0364] Flow rate: 35 mL / min

[0365] Column temperature: 25℃

[0366] Method A15: Synthesis of C74

[0367] Step 1: To a stirred solution of 2-azaspiro [3.3] heptane C74-1 (300 mg, 2.25 mmol, CL) in EtOH (3 mL) was added TEA (272.63 mg, 2.69 mmol, 375.78 μL) , the mixture was stirred for 5 mins, and the reaction mixture was added methyl oxirane-2-carboxylate C74-2 (229.21 mg, 2.25 mmol) , then the reaction mixture was heated to reflux for 1 h. After completion, the mixture was concentrated give methyl 2-hydroxy-3- (2-azaspiro [3.3] heptan-2-yl) propanoate C74-3 (400 mg, crude) as crude product. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 199.24

[0368] Step 2: To a stirred solution of methyl 3- (2-azaspiro [3.3] heptan-2-yl) -2-hydroxy-propanoate C74-3 (400 mg, 2.01 mmol) in Water (1 mL) and THF (4 mL) was added LiOH (72.12 mg, 3.01 mmol) and the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h. After completion, H2O (20 mL) was added to the reaction mixture, then the mixture was extracted with DCM (10 mL *3) , the aqueous phase was adjusted pH=2～3 with 1N HCl. The acidate aqueous phase was under lyophilization to give 3- (2-azaspiro [3.3] heptan-2-yl) -2-hydroxy-propanoic acid C74-4 (350 mg, crude) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 186.20

[0369] Step 3: To a stirred solution of (1S, 9S) -1-amino-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-1, 2, 3, 9, 12, 15-hexahydro-10H, 13H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13-dione EXT (150 mg, 344.47 μmol) , 3- (2-azaspiro [3.3] heptan-2-yl) -2-hydroxy-propanoic acid C74-4 (76.56 mg, 413.37 μmol) and DIEA (133.56 mg, 1.03 mmol, 180.00 μL) in DMF (1.46 mL) was added HATU (155.95 mg, 413.37 μmol) and the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was added H2O (20 mL) , then under lyophilization to give a residue, which was dissolved in mixture of DCM: MeOH (10: 1) and filtered, then the filtrate was concentrated under reduced pressure to give crude product, which was purified by Combi Flash (8%MeOH in DCM) to give 150 mg crude product. The crude product was purified by prep-HPLC to give N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -2-hydroxy-3- (2-azaspiro [3.3] heptan-2-yl) propanamide C74 (29.5 mg, 48.95 μmol, 14.21%yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 603.01

[0370] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0371] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0372] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0373] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0374] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0375] 2.6-3.5 min: 5%B

[0376] Flow rate: 1 mL / min

[0377] Column temperature: 25℃

[0378] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0379] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0380] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0381] Flow rate: 35 mL / min

[0382] Column temperature: 25℃

[0383] Method A16: Synthesis of C83

[0384] Step 1: To a solution of (2-amino-5-nitrophenyl) methanol C83-1 (500 mg, 2.98 mmol) in DCM (20 mL) was added manganese dioxide (1.3 g, 14.9 mmol) . Then the mixture was stirred at rt for 16 h. After completion, the mixture was filtered, and concentrated in vacuo, purified by column chromatography on silica gel to afford 2-amino-5-nitrobenzaldehyde C83-2 (190 mg) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 167.1.

[0385] Step 2: To a solution of 2-amino-5-nitrobenzaldehyde C83-2 (140 mg, 0.844 mmol) in conc. HCl (6 mL) and AcOH (15 mL) was added (S) -4-ethyl-4-hydroxy-7, 8-dihydro-1H-pyrano [3, 4-f] indolizine-3, 6, 10 (4H) -trione C83-2a (150 mg, 0.563 mmol) . The mixture was stirred at 110 C for 16 h. After completion, the mixture was concentrated in vacuo, purified by column chromatography on silica gel to afford (S) -4-ethyl-4-hydroxy-9-nitro-1, 12-dihydro-14H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-3, 14 (4H) -dione C83-3 (162 mg) . LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 394.13.

[0386] Step 3: To a solution of (S) -4-ethyl-4-hydroxy-9-nitro-1, 12-dihydro-14H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-3, 14 (4H) -dione C83-3 (200 mg, 0.51 mmol) was added 4, 4'-bipyridine (4 mg, 25.5 umol) and hypodiboric acid (140 mg, 1.53 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 15 min. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC to afford C83 (100.5 mg, 54.2 %) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 364.21.

[0387] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.22 (s, 1H) , 7.85 (d, J = 9.0 Hz, 1H) , 7.26 (d, J = 4.0 Hz, 1H) , 7.19 (s, 1H) , 6.90 (s, 1H) , 6.49 (s, 1H) , 5.97 (s, 1H) , 5.40 (s, 2H) , 5.. 18 (s, 2H) , 1.80 –1.91 (m, 2H) , 0.84 –0.90 (m, 3H) .

[0388] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0389] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0390] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0391] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0392] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0393] 2.6-3.5 min: 5%B

[0394] Flow rate: 1 mL / min

[0395] Column temperature: 25℃

[0396] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0397] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0398] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0399] Flow rate: 35 mL / min

[0400] Column temperature: 25℃

[0401] Method A17: Synthesis of C86

[0402] Step 1: To a solution of 2-amino-5-bromobenzaldehyde C86-1 (200 mg, 1 mmol) in THF (4 mL) was added but-3-en-1-ylmagnesium bromide (1M, 2.5 mL) by dropwise at 0 ℃ under nitrogen atmosphere. Then the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was quenched with saturated ammonium chloride and extracted with EtOAc. The combined organic phase was dried over Na2SO4, filtered, and concentrated in vacuo. The mixture was purified by column chromatography on silica gel to afford 1- (2-amino-5-bromophenyl) pent-4-en-1-ol C86-2 (90 mg) as a yellow solid.

[0403] Step 2: To a solution of 1- (2-amino-5-bromophenyl) pent-4-en-1-ol C86-2 (2 g, 8.2 mmol) in THF (40 mL) was added manganese dioxide (9 g, 98.4 mmol) at room temperature. Then the reaction mixture was stirred at room temperature for 16 h. After completion, the mixture was concentrated in vacuo and purified by column chromatography on silica gel to afford 1- (2-amino-5-bromophenyl) pent-4-en-1-one C86-3 (1.6 g) as yellow solid . LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 254.05

[0404] Step 3: To a mixture of 1- (2-amino-5-bromophenyl) pent-4-en-1-one (810 mg, 3.19 mmol) in toluene (15 mL) was added (S) -4-ethyl-4-hydroxy-7, 8-dihydro-1H-pyrano [3, 4-f] indolizine-3,6, 10 (4H) -trione C86-3a (700 mg, 2.66 mmol) and PPTS (1 g, 3.99 mmol) . Then the mixture was stirred at 110 ℃ for 16 h. After completion, the mixture was concentrated in vacuo and recrystallized with 30%EtOAc in MeOH to afford (S) -9-bromo-11- (but-3-en-1-yl) -4-ethyl-4-hydroxy-1, 12-dihydro-14H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-3, 14 (4H) -dione C86-4 (678 mg) as a crude product. The crude product was used directly for the next step without further purification.

[0405] Step 4: To a mixture of (S) -9-bromo-11- (but-3-en-1-yl) -4-ethyl-4-hydroxy-1, 12-dihydro-14H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-3, 14 (4H) -dione C86-4 (400 mg, 0.834 mmol) in 1, 4-dioxane (12 mL) was added tert-butyl carbamate C86-4a (490 mg, 4.17 mmol) , cesium carbonate (543 mg, 1.67 mmol) and xantphos Pd G3 (80 mg, 0.0834 mmol) . Then the mixture was stirred at 85 ℃ for 2 h under atmosphere. After completion, the mixture was concentrated in vacuo and purified by column chromatography on silica gel to afford tert-butyl (S) - (11- (but-3-en-1-yl) -4-ethyl-4-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-9-yl) carbamate C86-5 (203 mg) as a yellow solid. [M+H] + found, 518.25.

[0406] Step 5: To a solution of tert-butyl (S) - (11- (but-3-en-1-yl) -4-ethyl-4-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-9-yl) carbamate compound 5 (198 mg, 0.38 mmol) in DCM (5 mL) was added TFA (2.5 mL) . Then the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was evaporated to dryness. The crude product was purified by Prep-HPLC to give the desired product (S) -9-amino-11- (but-3-en-1-yl) -4-ethyl-4-hydroxy-1, 12-dihydro-14H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-3, 14 (4H) -dione C86 (57 mg, 35.8%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 418.21.

[0407] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.85 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 7.26 (d, J = 12 Hz, 1H) , 7.18 (s, 1H) , 7.06 –7.09 (m, 1H) , 6.46 (s, 1H) , 5.96 –6.02 (m, 3H) , 5.40 –5.42 (m, 3H) , 5.18 –5.22 (m, 2H) , 5.02 –5.15 (m, 2H) , 3.07 –3.11 (m, 2H) , 2.42 –2.48 (m, 2H) , 1.61 –1.91 (m, 2H) , 0.88 (t, J=8.0 Hz, 3H)

[0408] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0409] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0410] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0411] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0412] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0413] 2.6-3.5 min: 5%B

[0414] Flow rate: 1 mL / min

[0415] Column temperature: 25℃

[0416] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0417] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0418] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0419] Flow rate: 35 mL / min

[0420] Column temperature: 25℃

[0421] Method A18: Synthesis of C99

[0422] Step 1: To a solution of 2-cyclopropylacetic acid C99-1 (4 g, 39.95 mmol) in MeCN (80 mL) was added N, O-Dimethylhydroxylamine hydrochloride C99-2 (4.68 g, 47.94 mmol) , 1-Methylimidazole NMI (13.28 g, 159.82 mmol) , 0℃ added TCFH (1.73 g, 47.94 mmol) . The reaction mixture was stirred for 1h at rt. After completion, the resulting mixture was extracted with DCM (3 × 50 mL) and organic layer was washed with water (50 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate, filtration and concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by silica gel (10%EA in PE) to give desired product 2-cyclopropyl-N-methoxy-N-methylacetamide C99-3 (2 g, 35.0%yield) as colorless oil . LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 144.18.

[0423] Step 2: To a solution of Diisopropylamine (1.55 g, 15.36 mmol) in THF (40 mL) was added n-Butyllithium (984.12 mg, 15.36 mmol) at -78℃ under nitrogen atmosphere, the reaction mixture was stirred for 15 mins. Then the 1-bromo-4-fluoro-benzene C99-4 (2.44 g, 13.97 mmol) in 1 mL THF was added to above solution dropwise and stirred for 20 mins. Then 2-cyclopropyl-N-methoxy-N-methyl-acetamide C99-3 (2 g, 13.97 mmol) in 1 mL THF was added to the reaction solution dropwise and stirred for 20 mins. The resulting reaction solution was allowed to warm up to room temperature for over 20 mins. After completion, the reaction mixture was quenched with NH4Cl (50 mL) and extracted with EA (50 mL) for 3 times, dried over anhydrous sodium sulfate, filtration and concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by Flash (PE: EA=10: 1) to give desired product 1- (5-bromo-2-fluorophenyl) -2-cyclopropylethan-1-one C99-5 (1.5 g, 41.8%yield) as a yellow solid . LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 257.12.

[0424] Step 3: To a solution of 1- (5-bromo-2-fluoro-phenyl) -2-cyclopropyl-ethanone C99-5 (850 mg, 3.31 mmol) in DMSO , 4-Methoxybenzylamine (2.27 g, 16.53 mmol) and DIEA (1.71 g, 13.22 mmol, 2.30 mL) were added. The reaction mixture was heated to 100℃ and kept under stirring at this temperature for 8 h. After completion, the resulting mixture was extracted with EA (3 × 50 mL) and organic layers were washed with water (50 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate, filtration and concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by Flash (PE: EA=5: 1) to give desired product (Z) -4-bromo-2- (2-cyclopropyl-1- ( (4-methoxybenzyl) imino) ethyl) -N- (4-methoxybenzyl) aniline C99-6 (500 mg, 30.7%yield) as a yellow solid . LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 493.60.

[0425] Step 4: To a stirred solution of 4-bromo-2- [ (Z) -C- (cyclopropylmethyl) -N- [ (4-methoxyphenyl) methyl] carbonimidoyl] -N- [ (4-methoxyphenyl) methyl] aniline C99-6 (500 mg, 1.01 mmol) in TFA (115.54 mg, 1.01 mmol, 5 mL) and the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 3 h. After completion, the mixture was evaporated to dryness. The resulting mixture was extracted with DCM (3 × 30 mL) and organic layers were washed with saturated NaHCO3 (30 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate, filtration and concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by Flash (PE: EA=4: 1) to give desired product 1- (2-amino-5-bromophenyl) -2-cyclopropylethan-1-one C99-7 (260 mg, 100%yield) as yellow oil . LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 254.32

[0426] Step 5: 1- (2-amino-5-bromo-phenyl) -2-cyclopropyl-ethanone C99-8 (260.64 mg, 1.03 mmol) , (4S) -4-ethyl-4-hydroxy-7, 8-dihydro-1H-pyrano [3, 4-f] indolizine-3, 6, 10-trione compound 8 (270 mg, 1.03 mmol) and Pyridinium p-Toluenesulfonate (386.62 mg, 1.54 mmol) were dissolved in Tol (3 mL) . The reaction was heated to 110℃ for 8 hours. After completion, the mixture was evaporated to dryness. The crude product was purified by Flash (5%MeOH in DCM) to give desired product (S) -9-bromo-11- (cyclopropylmethyl) -4-ethyl-4-hydroxy-1, 12-dihydro-14H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-3, 14 (4H) -dione C99-9 (400 mg, 81.0%yield) as a yellow solid . LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 481.55 .

[0427] Step 6: To a solution of (S) -9-bromo-11- (cyclopropylmethyl) -4-ethyl-4-hydroxy-1, 12-dihydro-14H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-3, 14 (4H) -dione compound 9 (300 mg, 623.26 μmol) in dioxane (3 mL) stirred under nitrogen was added tert-butyl carbamate C99-10 (365.08 mg, 3.12 mmol) , XantPhos Pd G3 (59.11 mg, 62.33 μmol) , Caesium carbonate (406.14 mg, 1.25 mmol) . The reaction mixture was stirred at 85 ℃ for 6 h. After completion, the resulting mixture was concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by Flash (10%-25%MeOH in DCM) to give desired product tert-butyl (S) - (11- (cyclopropylmethyl) -4-ethyl-4-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-9-yl) carbamate C99-11 (80 mg, 24.8%yield) as a brown solid . LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 518.42.

[0428] Step 7: To a solution of tert-butyl (S) - (11- (cyclopropylmethyl) -4-ethyl-4-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-9-yl) carbamate C99-11 (70 mg, 135.25 μmol) in DCM (2 mL) stirred at 25 ℃ was added TFA (15.42 mg, 135.25 μmol, 1 mL) . The reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was evaporated to dryness. The crude product was purified by Prep-HPLC to give desired product (S) -9-amino-11- (cyclopropylmethyl) -4-ethyl-4-hydroxy-1, 12-dihydro-14H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-3, 14 (4H) -dione C99 (24.5 mg, 58.7%yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 418.17.

[0429] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.87 (d, J = 9.0 Hz, 1H) , 7.27 (dd, J = 9.0, 2.3 Hz, 1H) , 7.19 (s, 1H) , 7.18 (d, J = 2.2 Hz, 1H) , 5.41 (s, 2H) , 5.23 (s, 2H) , 2.99 (d, J = 6.7 Hz, 2H) , 1.92 –1.77 (m, 2H) , 1.22 –1.15 (m, 1H) , 0.87 (m, 3H) , 0.51 –0.44 (m, 2H) , 0.38 (m, 2H) .

[0430] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0431] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0432] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0433] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0434] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0435] 2.6-3.5 min: 5%B

[0436] Flow rate: 1 mL / min

[0437] Column temperature: 25℃

[0438] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0439] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0440] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0441] Flow rate: 35 mL / min

[0442] Column temperature: 25℃

[0443] Method A19: Synthesis of C101

[0444] Step 1: To a solution of 2-amino-5-bromobenzaldehyde C101-1 (9 g, 45 mmol) in THF (80 mL) was added (E) -prop-1-en-1-ylmagnesium bromide (0.5M, 189 mL) by dropwise at 0 ℃ under nitrogen atmosphere. Then the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was quenched with saturated ammonium chloride and extracted with EtOAc. The combined organic phase was dried over Na2SO4, filtered, and concentrated in vacuo. The mixture was purified by column chromatography on silica gel to afford 1- (2-amino-5-bromophenyl) pent-4-en-1-ol C101-2 (1.5 g) as a yellow solid.

[0445] Step 2: To a solution of 1- (2-amino-5-bromophenyl) pent-4-en-1-ol C101-2 (100 m g, 0.413 mmol) in DCM (5 mL) was added manganese dioxide (360 mg, 4.13 mmol) at room temperature. Then the reaction mixture was stirred at room temperature for 16 h. After completion, the mixture was concentrated in vacuo and purified by column chromatography on silica gel to afford (E) -1- (2-amino-5-bromophenyl) but-2-en-1-one C101-3 (65 mg) as yellow solid . LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 240.01

[0446] Step 3: To a mixture of (E) -1- (2-amino-5-bromophenyl) but-2-en-1-one (900 mg, 3.75 mmol) in toluene (15 mL) was added (S) -4-ethyl-4-hydroxy-7, 8-dihydro-1H-pyrano [3, 4-f] indolizine-3,6, 10 (4H) -trione C101-3a (986 mg, 3.75 mmol) and PPTS (1.41 g, 5.625 mmol) . Then the mixture was stirred at 110 ℃ for 16 h. After completion, the mixture was concentrated in vacuo and recrystallized with 30%EtOAc in MeOH to afford (S, E) -9-bromo-4-ethyl-4-hydroxy-11- (prop-1-en-1-yl) -1, 12-dihydro-14H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-3, 14 (4H) -dione C101-4 (366 mg) as a crude product. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 467.11.

[0447] Step 4: To a mixture of (S, E) -9-bromo-4-ethyl-4-hydroxy-11- (prop-1-en-1-yl) -1, 12-dihydro-14H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-3, 14 (4H) -dione C101-4 (336 mg, 0.72 mmol) in 1, 4-dioxane (10 mL) was added tert-butyl carbamate C101-4a (421 mg, 3.6 mmol) , cesium carbonate (470 mg, 1.44 mmol) and xantphos Pd G3 (70 mg, 0.072 mmol) . Then the mixture was stirred at 85 ℃ for 2 h under nitrogen atmosphere. After completion, the mixture was concentrated in vacuo and purified by column chromatography on silica gel to afford tert-butyl (S, E) - (4-ethyl-4-hydroxy-3, 14-dioxo-11- (prop-1-en-1-yl) -3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-9-yl) carbamate (30 mg) C101-5 as a yellow solid. [M+H] + found, 504.25.

[0448] Step 5: To a solution of tert-butyl (S, E) - (4-ethyl-4-hydroxy-3, 14-dioxo-11- (prop-1-en-1-yl) -3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-9-yl) carbamate (30 mg) C101-5 (30 mg, 0.06 mmol) in DCM (2.5 mL) was added TFA (1 mL) . Then the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was evaporated to dryness. The crude product was purified by Prep-HPLC to give the desired product (S, E) -9-amino-4-ethyl-4-hydroxy-11- (prop-1-en-1-yl) -1, 12-dihydro-14H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-3, 14 (4H) -dione C101 (7 mg, 28.8%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 404.21.

[0449] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.75 -7.85 (m, 1H) , 7.18 –7.27 (m, 1H) , 7.15 –7.19 (m, 2H) , 6.92 –7.09 (m, 1H) , 6.41 –6.51 (m, 2H) , 5.48 (s, 2H) , 5.25 –5.31 (m, 2H) , 2.01 –2.12 (m, 2H) , 1.82 –1.88 (m, 2H) , 0.88 (t, J=8.0 Hz, 3H)

[0450] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0451] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0452] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0453] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0454] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0455] 2.6-3.5 min: 5%B

[0456] Flow rate: 1 mL / min

[0457] Column temperature: 25℃

[0458] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0459] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0460] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0461] Flow rate: 35 mL / min

[0462] Column temperature: 25℃

[0463] Method A20: Synthesis of C106

[0464] Step 1: To a solution of 6-nitro-1, 3-benzodioxole-5-carbaldehyde (C106-1) (10.5 g, 53.81 mmol) and Fe (15.03 g, 269.05 mmol) in MeOH (100 mL) and water (50 mL) was added ammonium chloride (13.85 g, 269.05 mmol) . The mixture was stirred at 70 ℃ for 2 h. After completed reaction, the mixture was filtered and concentrated in vacuum. The mixture was diluted with Na2CO3 aq. (50 mL) , extracted with EtOAc (200 mL*3) . The organic layer was combined and dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by a silica gel column chromatography to afford 6-aminobenzo [d] [1, 3] dioxole-5-carbaldehyde C106-2 (4.3 g, 26.04 mmol, 48.39%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 166.21

[0465] Step 2: To a solution of 6-aminobenzo [d] [1, 3] dioxole-5-carbaldehyde C106-2 (2 g, 12.11 mmol) and (4S) -4-ethyl-4-hydroxy-7, 8-dihydro-1H-pyrano [3, 4-f] indolizine-3, 6, 10-trione (C106-2a) (3.19 g, 12.11 mmol) in toluene (60 mL) was added p-toluenesulfonic acid (208.55 mg, 1.21 mmol) . The mixture was stirred at 120 ℃ for 16 h. After completion, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue. The mixture was triturated with EtOH (60 mL) to afford (S) -7-ethyl-7-hydroxy-10, 13-dihydro-11H- [1, 3] dioxolo [4, 5-g]pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-8, 11 (7H) -dione C106-3 (3.37 g, 8.59 mmol, 70.92%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 393.16.

[0466] Step 3: To a solution of (S) -7-ethyl-7-hydroxy-10, 13-dihydro-11H- [1, 3] dioxolo [4, 5-g] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-8, 11 (7H) -dione C106-3 (2 g, 5.10 mmol) in H2SO4 (20 mL) was added potassium nitrate (773.04 mg, 7.65 mmol) at 0 ℃. The mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was quenched with ice-water (200 mL) and filtered. The solid was triturated with aq. NaHCO3 and EtOH (60 mL) to afford (S) -7-ethyl-7-hydroxy-15-nitro-10, 13-dihydro-11H- [1, 3] dioxolo [4, 5-g] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-8, 11 (7H) -dione C106-4 (1.7 g, 3.89 mmol, 76.25%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 438.20.

[0467] Step 4: To a stirred solution of (S) -7-ethyl-7-hydroxy-15-nitro-10, 13-dihydro-11H- [1, 3] dioxolo [4, 5-g] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-8, 11 (7H) -dione C106-4 (1.6 g, 3.66 mmol) and 4, 4'-Bipyridine (114.27 mg, 731.67 μmol) in DMF (25 mL) was added tetrahydroxydiboron (C106-4a) (983.91 mg, 10.97 mmol) . The reaction mixture was stirred at 0 ℃ for 2.5 h. After completion, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue. The mixture was triturated with H2O (50 mL) and MeCN (50 mL) to afford (S) -15-amino-7-ethyl-7-hydroxy-10, 13-dihydro-11H- [1, 3] dioxolo [4, 5-g] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b]quinoline-8, 11 (7H) -dione C106 (1.43 g, 3.23 mmol, 88.37%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 408.07.

[0468] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.75 (s, 1H) , 7.23 (s, 1H) , 6.93 (s, 1H) , 6.49 (s, 1H) , 6.19 (s, 2H) , 5.76 (s, 2H) , 5.42 (s, 2H) , 5.23 (s, 2H) , 1.92 –1.81 (m, 2H) , 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0469] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0470] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0471] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0472] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0473] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0474] 2.6-3.5 min: 5%B

[0475] Flow rate: 1 mL / min

[0476] Column temperature: 25℃

[0477] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0478] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0479] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0480] Flow rate: 35 mL / min

[0481] Column temperature: 25℃

[0482] The compounds in table 1 were synthesized as above.

[0483] Table 1. compounds provided by this invention

[0484] Method B: preparation of linker-payloads

[0485] Method B1: Synthesis of C9

[0486] N- ( (2S, 10S) -10-benzyl-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-2- (pyrrolidin-1-ylmethyl) -3-oxa-5, 8, 11, 14-tetraazahexadecan-16-yl) -1- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) propanamido) -3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24-octaoxaheptacosan-27-amide

[0487] Step 1 -synthesis of C9-2

[0488] To a solution of C9-1 (90 mg, 0.14 mmol) and (S) -2-hydroxy-3- (pyrrolidin-1-yl) propanoic acid (160 mg, 1.0 mmol) in DCM (2.0 mL) was added TFA (20 uL) . The resulting mixture was stirred at RT for 12 h. The mixture was then concentrated to dryness under reduced pressure, redissolved in DMF, and purified by reverse phase column chromatography to afford compound 7 as a solid. MS (m / z) : 729 [M+H] ,

[0489] Step 2 -synthesis of C9-3

[0490] To a stirred solution of compound 7 (73 mg, 0.10 mmol) and HATU (46 mg, 0.12 mmol) in DMF (2 mL) were added exetecan mesylate (53 mg, 0.10 mmol) . After stirring at RT for 10 minutes, the mixture was treated with 4-methylpiperidine (60 pL, 0.51 mmol) and stirred for another 2 h. The mixture was purified via reverse phase column chromatography to afford compound 8 as a solid. MS (m / z) : 1146 [M+H] ,

[0491] Step 3 -synthesis of C9

[0492] To a solution of C9-3 (66 mg, 0.057 mmol) ) in DMF (1.0 mL) was added disopropylamine (1 mL) . After stirring at room temp for 5h, The mixture was then concentrated to dryness under reduced pressure, redissolved in DMF, MA-peg8-acid (38 mg) , pyAOP (30 mg, 0.06 mmol) and DIEA (25 uL) was sequentially added. The reaction was stirred at RT for ～5 min before purified by reverse phase column chromatography to afford C9 as a yellow solid. MS (m / z) : 1498 [M+H] .

[0493] Method B2: Synthesis of C13

[0494] Step 1: To a solution of 2-methylsulfanylpyrimidine-5-carboxylic acid (C13-1) (2.06 g, 12.12 mmol) and DIEA (4.48 g, 34.63 mmol, 6.03 mL) in DCM (60 mL) was added HATU (5.23 g, 13.85 mmol) at 0℃ for 30 min, then the reaction mixture was added tert-butyl (2S) -2-amino-3-methyl-butanoate (C13-1a) (2 g, 11.54 mmol) at 0℃. Then the mixture was stirred at 0 ℃ for 16 h.After completion, the mixture was diluted with H2O (30 mL) , extracted with DCM (50 mL*3) . The organic layer was combined and dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by a silica gel column chromatography to afford tert-butyl (2-(methylthio) pyrimidine-5-carbonyl) -L-valinate C13-2 (3.4 g, 10.45 mmol, 90.51%) as a yellow oil. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 326.21

[0495] Step 2: To a solution of tert-butyl (2- (methylthio) pyrimidine-5-carbonyl) -L-valinate C13-2 (3.3 g, 10.14 mmol) in DCM (17 mL) was added TFA (1.16 g, 10.14 mmol, 17 mL) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was concentrated in vacuum to afford (2- (methylthio) pyrimidine-5-carbonyl) -L-valine C13-3 (2.7 g, crude) as a yellow solid. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 270.16.

[0496] Step 3: To a solution of (2- (methylthio) pyrimidine-5-carbonyl) -L-valine C13-3 (2.7 g, 10.03 mmol) and DIEA (4.53 g, 35.09 mmol, 6.11 mL) in DCM (60 mL) was added HATU (4.54 g, 12.03 mmol) at 0℃ for 15 min, then the reaction mixture was added tert-butyl (2S) -2-aminopropanoate (C13-3a) (1.46 g, 10.03 mmol) at 0℃. The mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was diluted with H2O (30 mL) , extracted with DCM (50 mL*3) . The organic layer was combined and dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by a silica gel column chromatography to afford tert-butyl (2- (methylthio) pyrimidine-5-carbonyl) -L-valyl-L-alaninate C13-4 (1.72 g, 4.34 mmol, 43.27%) as a white solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 397.20.

[0497] Step 4: To a solution of tert-butyl (2- (methylthio) pyrimidine-5-carbonyl) -L-valyl-L-alaninate C13-4 in DCM (33 mL) was added m-chloroperoxybenzoic acid (2.35 g, 10.21 mmol, 75%purity) at 0℃. The mixture was stirred at 20 ℃ for 16 h. After completion, the mixture was diluted with water (30 mL) , extracted with DCM (50 mL*3) . The organic layer was combined and quenched by Na2S2O3 (50 mL) , dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by a silica gel column chromatography to afford tert-butyl (2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carbonyl) -L-valyl-L-alaninate C13-5 (1.5 g, 3.50 mmol, 85.68%) as a white solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 429.31.

[0498] Step 5: To a solution of tert-butyl (2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carbonyl) -L-valyl-L-alaninate C13-5 in DCM (3 mL) was added TFA (79.83 mg, 700.11 μmol, 1 mL) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 16 h. After completion, the mixture was concentrated in vacuum. The mixture was purified by Prep-HPLC to afford (2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carbonyl) -L-valyl-L-alanine C13-6 (136 mg, 365.20 μmol, 52.16%) as a white solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 373.12.

[0499] Step 6: To a solution of C11 (50 mg, 91.32 μmol) and (2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carbonyl) -L-valyl-L-alanine C13-6 (34.01 mg, 91.32 μmol) in DMF (1.7 mL) was added DIEA (59.01 mg, 456.59 μmol, 79.53 μL) at 0℃, then the reaction mixture was added HATU (41.34 mg, 109.58 μmol) at 0℃. The mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC to afford N- ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) -2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carboxamide C13 (57 mg, 63.14 μmol, 69.14%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 902.33.

[0500] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.40-9.30 (m, 2H) , 8.92-9.72 (m, 1H) , 8.64 (d, J = 8.3 Hz, 1H) , 8.54-8.32 (m, 1H) , 8.27 (d, J = 6.7 Hz, 1H) , 7.86-7.74 (m, 1H) , 7.36-7.28 (m, 1H) , 6.54 (s, 1H) , 5.60 –5.19 (m, 5H) , 4.57 –4.47 (m, 1H) , 4.34 –4.23 (m, 2H) , 3.68-3.56 (m, 2H) , 3.52-3.40 (m, 3H) , 3.25-3.10 (m, 2H) , 2.43-2.38 (m, 3H) , 2.25-1.75 (m, 5H) , 1.21 (t, J = 6.9 Hz, 3H) , 0.90 –0.79 (m, 9H) .

[0501] Method B3: Synthesis of C117

[0502] Step 1: To a solution of 2-methylsulfanylpyrimidine-5-carboxylic acid (C117-1) (3.01 g, 17.68 mmol) and DIEA (6.23 g, 48.23 mmol, 8.40 mL) in DCM (120.00 mL) was added HATU (7.88 g, 20.90 mmol) at 0℃ for 30 min, then the reaction mixture was added tert-butyl 1-amino-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24-octaoxaheptacosan-27-oate (C117-1a) (8.00 g, 16.08 mmol) at 0℃ and stirred at 20 ℃ for 16 h. After completion, the mixture was diluted with water (100 mL) , extracted with DCM (100 mL*3) . The organic layer was combined and dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by a silica gel column chromatography to afford tert-butyl 1- (2- (methylthio) pyrimidin-5-yl) -1-oxo-5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26-octaoxa-2-azanonacosan-29-oate C117-2 (10.4 g, 16.01 mmol, 99.56%) was obtained as a brown oil. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 650.21

[0503] Step 2: To a solution of tert-butyl 1- (2- (methylthio) pyrimidin-5-yl) -1-oxo-5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26-octaoxa-2-azanonacosan-29-oate C117-2 (10.4 g, 16.01 mmol) in DCM (180.00 mL) was added m-chloroperoxybenzoic acid (8.12 g, 40.01 mmol, 85%purity) at 0℃. Then the mixture was stirred at 20 ℃ for 16 h. After completion, the mixture was diluted with water (100 mL) , extracted with DCM (100 mL*3) . The organic layer was combined and quenched by Na2S2O3 (100 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated in vacuum. The residue was purified by a silica gel column chromatography to afford tert-butyl 1- (2- (methylsulfonyl) pyrimidin-5-yl) -1-oxo-5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26-octaoxa-2-azanonacosan-29-oate C117-3 (10.9 g, 15.99 mmol, 99.89%yield) as a yellow oil. LCMS-ESI (m / z) : [M-56+H] + found, 626.35.

[0504] Step 3: To a solution of tert-butyl 1- (2- (methylsulfonyl) pyrimidin-5-yl) -1-oxo-5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26-octaoxa-2-azanonacosan-29-oate C117-3 (10.9 g, 15.99 mmol) in DCM (30.00 mL) was added TFA (7.42 g, 65.07 mmol, 10.00 mL) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 16 h. After completion, the mixture was concentrated in vacuum. The mixture was purified by Prep-HPLC (FA) to afford 1- (2- (methylsulfonyl) pyrimidin-5-yl) -1-oxo-5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26-octaoxa-2-azanonacosan-29-oic acid C117-4 (5.8 g, 9.27 mmol, 57.98%yield) as a yellow oil. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 626.20.

[0505] Step 4: To a solution of (R) -2-amino-3-azido-N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) propanamide (C11) (3.38 g, 6.17 mmol) and 2- [ [ (2S) -2- [ [2- [ [2- (tert-butoxycarbonylamino) acetyl] amino] acetyl] amino] -3-phenyl-propanoyl] amino] acetic acid (C117-2a) (2.69 g, 6.17 mmol) and DIEA (3.99 g, 30.87 mmol, 5.38 mL) in DMF (90.00 mL) was added HATU (2.79 g, 7.41 mmol) at 0℃. Then the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC (TFA) to afford tert-butyl ( (7S, 13R) -13- (azidomethyl) -7-benzyl-14- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -2, 5, 8, 11, 14-pentaoxo-3, 6, 9, 12-tetraazatetradecyl) carbamate C117-5 (4.89 g, 82.0%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 966.20.

[0506] Step 5: To a solution of tert-butyl ( (7S, 13R) -13- (azidomethyl) -7-benzyl-14- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -2, 5, 8, 11, 14-pentaoxo-3, 6, 9, 12-tetraazatetradecyl) carbamate C117-5 (2.00 g, 2.07 mmol) in DCM (10.00 mL) was added TFA (1.48 g, 13.01 mmol, 2.00 mL) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 2 h. After completion, the mixture was concentrated in vacuum to afford (S) -2- (2- (2-aminoacetamido) acetamido) -N- (2- ( ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -3-phenylpropanamide C117-6 (2.03 g, crude) as a yellow solid. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 866.12.

[0507] Step 6: To a solution of (S) -2- (2- (2-aminoacetamido) acetamido) -N- (2- ( ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -3-phenylpropanamide C117-6 and 1- (2- (methylsulfonyl) pyrimidin-5-yl) -1-oxo-5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26-octaoxa-2-azanonacosan-29-oic acid C117-4 (1.30 g, 2.07 mmol) and DIEA (1.07 g, 8.30 mmol, 1.44 mL) in DMF (40.00 mL) was added HATU (938.86 mg, 2.49 mmol) at 0℃. Then the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC (TFA) to afford N- ( (35S, 41R) -41- (azidomethyl) -35-benzyl-42- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -27, 30, 33, 36, 39, 42-hexaoxo-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24-octaoxa-28, 31, 34, 37, 40-pentaazadotetracontyl) -2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carboxamide C117 (1.36 g, 864.81 μmol, 41.70%, 93.7%purity) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M / 2+H] + found, 737.75.

[0508] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.37 (s, 2H) , 9.13 (t, J = 5.5 Hz, 1H) , 8.77 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 8.38 (d, J = 7.9 Hz, 1H) , 8.23 (t, J = 5.5 Hz, 1H) , 8.14 (t, J = 5.7 Hz, 1H) , 8.09 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 7.96 (t, J = 5.7 Hz, 1H) , 7.81 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.32 (s, 1H) , 7.25 –7.20 (m, 2H) , 7.19-7.14 (m, 3H) , 6.51 (s, 1H) , 5.62 –5.56 (m, 1H) , 5.46-5.32 (m, 2H) , 5.24 (s, 2H) , 4.54 –4.43 (m, 2H) , 3.80 –3.53 (m, 18H) , 3.50 –3.45 (m, 27H) , 3.19 (s, 2H) , 2.94-2.86 (m, 1H) , 2.73 –2.66 (m, 1H) , 2.44-2.30 (m, 5H) , 2.25 –2.09 (m, 2H) , 1.89 –1.78 (m, 2H) , 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0509] Method B4: Synthesis of C118

[0510] Step 1: To a solution of (1S, 9S) -1-amino-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-1, 2, 3, 9, 12, 15-hexahydro-10H, 13H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13-dione C118-1 (3 g, 5.64 mmol, MS) , (2R) -3-azido-2- (tert-butoxycarbonylamino) propanoic acid C118-2 (1.43 g, 6.21 mmol) and DIEA (2.92 g, 22.58 mmol, 3.93 mL) in DMF (60 mL) was added HATU (2.77 g, 7.34 mmol) at 0℃. Then the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion, the crude product was purified by Prep-HPLC to give desired product tert-butyl ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) carbamate C118-3 (3 g, 82.07%yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 648.18.

[0511] Step 2: To a solution of tert-butyl ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) carbamate C118-3 (4.2 g, 6.48 mmol) in DCM (100 mL) was added TFA (739.42 mg, 6.48 mmol, 20 mL) . Then the reaction mixture was stirred at 25℃ for 1 h. After completion, the mixture was evaporated to dryness. The crude product (R) -2-amino-3-azido-N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) propanamide C118-4 (4.2 g, 97.90%yield, TF) was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 548.08.

[0512] Step 3: To a solution of (R) -2-amino-3-azido-N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) propanamide C118-4 (4.2 g, 8.22 mmol) and (2S) -2- [ [ (2S) -2- (tert-butoxycarbonylamino) -3-methyl-butanoyl] amino] propanoic acid C118-5 (2.61 g, 9.04 mmol) in DMF (45 mL) was added HATU (3.72 g, 9.86 mmol) and DIEA (5.31 g, 41.09 mmol, 7.16 mL) at 25℃. Then the mixture was stirred at 25℃ for 1 h. After completion, the resulting mixture was extracted with EtOAc (3 × 200 mL) and organic layers were washed with water (200 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate, filtration and concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by Flash (10%MeOH in DCM) to give the desired product tert-butyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) carbamate C118-6 (5.68 g, 84.50%yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 818.28.

[0513] Step 4: To a solution of tert-butyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) carbamate C118-6 (5.68 g, 6.94 mmol) in DCM (60 mL) stirred at 25℃ was added TFA (791.86 mg, 6.94 mmol, 20 mL) . Then the reaction mixture was stirred at 25℃ for 1 h. After completion, the mixture was evaporated to dryness. The crude product (S) -2-amino-N- ( (S) -1- ( ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) -3-methylbutanamide C118-7 (5.6 g, crude, TF) was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 718.24.

[0514] Step 5: To a stirred solution of (S) -2-amino-N- ( (S) -1- ( ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) -3-methylbutanamide C118-7 (5.6 g, 7.69 mmol, TF) in DMF (64 mL) was added pyridine (3.04 g, 38.47 mmol, 3.10 mL) at 25 ℃, then the reaction mixture was added 2-bromoacetyl bromide (2.17 g, 10.77 mmol) in THF (5 mL) at 0 ℃ and stirred at 25 ℃ for 30 min. After completion, the reaction mixture was added with TFA to adjust pH = 2. The crude product was purified by Prep-HPLC to give desired product (S) -N- ( (S) -1- ( ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) -2- (2-bromoacetamido) -3-methylbutanamide C118 (1 g, 15.50%yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 838.23.

[0515] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.59 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 8.43 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 8.21 (d, J = 6.4 Hz, 1H) , 8.01 (d, J = 8.9 Hz, 1H) , 7.82 (d, J = 11.0 Hz, 1H) , 7.33 (s, 1H) , 6.52 (s, 1H) , 5.65 –5.20 (m, 5H) , 4.53-4.44 (m, 1H) , 4.28-4.16 (m, 1H) , 4.14-4.08 (m, 1H) , 3.95 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 3.85 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 3.65 (d, J = 6.2 Hz, 2H) , 3.17 (s, 2H) , 2.42 (d, J = 1.9 Hz, 3H) , 2.28-1.65 (m, 5H) , 1.18 (d, J = 7.0 Hz, 3H) , 0.88 (t, J = 7.4 Hz, 3H) , 0.73 (dd, J = 13.6, 6.8 Hz, 6H) .

[0516] Method B5: Synthesis of C126

[0517] Step 1: To a solution of 2-methylsulfanylpyrimidine-5-carboxylic acid (C126-1) (1.00 g, 5.88 mmol) and DIEA (3.04 g, 23.50 mmol, 4.09 mL) in DCM (40 mL) was added HATU (2.44 g, 6.46 mmol) at 0℃ for 15 min, then the reaction mixture was added tert-butyl (2S) -2-amino-6- (tert-butoxycarbonylamino) hexanoate (C126-1a) (2.19 g, 6.46 mmol, HCl) at 0℃ and stirred at 25 ℃ for 16 h. After completion, the mixture was diluted with water (30 mL) , extracted with DCM (50 mL*3) . The organic layer was combined and dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by a silica gel column chromatography to afford tert-butyl N6- (tert-butoxycarbonyl) -N2- (2- (methylthio) pyrimidine-5-carbonyl) -L-lysinate C126-2 (1.9 g, 4.18 mmol, 71.13%) as a white solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 455.21

[0518] Step 2: To a solution of tert-butyl N6- (tert-butoxycarbonyl) -N2- (2- (methylthio) pyrimidine-5-carbonyl) -L-lysinate C126-2 (0.5 g, 1.10 mmol) in DCM (2.50 mL) was added TFA (125.42 mg, 1.10 mmol, 2.5 mL) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 2 h. After completion, the mixture was concentrated in vacuum to afford (2- (methylthio) pyrimidine-5-carbonyl) -L-lysine C126-3 (328 mg, crude) . The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 299.17.

[0519] Step 3: To a solution of (2- (methylthio) pyrimidine-5-carbonyl) -L-lysine C126-3 (328 mg, 1.10 mmol) and DIEA (426.25 mg, 3.30 mmol, 574.46 μL) in DMF (1.04 mL) was added 2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxahexacosan-26-oate (588.17 mg, 1.15 mmol) (C126-3a) at 0℃. Then the mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC to afford tert-butyl (S) -32- (2- (methylthio) pyrimidine-5-carboxamido) -26-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-27-azatritriacontan-33-oic acid C126-4 (600 mg, 866.03 μmol, 78.78%) as a colorless oil. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 693.20.

[0520] Step 4: To a solution of tert-butyl (S) -32- (2- (methylthio) pyrimidine-5-carboxamido) -26-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-27-azatritriacontan-33-oic acid C126-4 (0.5 g, 721.69 μmol) and sodium tungstate dihydrate (10.42 mg, 36.08 μmol) in water (1.7 mL) and MeCN (5 mL) was added H2O2 (327.31 mg, 2.89 mmol, 30%purity) . Then th mixture was stirred at 70 ℃ for 3 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC to afford (S) -32- (2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carboxamido) -26-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-27-azatritriacontan-33-oic acid C126-5 (460 mg, 634.64 μmol, 87.94%) as a colorless oil. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 725.31.

[0521] Step 5: To a solution of 2- [ [ (2S) -2- [ [2- [ [2- (9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino) acetyl] amino] acetyl] amino] -3-phenyl-propanoyl] amino] acetic acid (C126-4a) (10 g, 17.90 mmol) , tert-butyl 2-aminoacetate (C126-5a) (2.47 g, 18.80 mmol) and DIEA (5.78 g, 44.76 mmol, 7.80 mL) in DMF (130 mL) was added HATU (8.10 g, 21.48 mmol) at 0 ℃. Then the mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was quenched with ice-water (500 mL) and filtered. The mixture was triturated by EtOH (200 mL) to afford tert-butyl ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanylglycylglycinate C126-6 (10.4 g, crude) as a white solid. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 672.32.

[0522] Step 6: To a solution of tert-butyl ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanylglycylglycinate C126-6 (9.8 g, 14.59 mmol) in DCM (50.0 mL) was added TFA (1.66 g, 14.59 mmol, 50 mL) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 2 h. After completion, the mixture was concentrated in vacuum to afford ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanylglycylglycine C126-7 (8.9 g, crude) as a white solid. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 616.22.

[0523] Step 7: To a solution of ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanylglycylglycine C126-7 (3 g, 4.87 mmol) , lead tetraacetate (2.59 g, 5.85 mmol) and copper (II) acetate (265.53 mg, 1.46 mmol) in DMF (30 mL) was added acetic acid (585.27 mg, 9.75 mmol) . Then the mixture was stirred at 60 ℃ for 3 h under N2 atmosphere. After completion, the mixture was diluted with water (150 mL) , extracted with EtOAc (200 mL*3) . The organic layer was combined and dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The mixture was triturated by petroleum ether: EtOAc = 1: 1 (100 mL) to afford (S) -11-benzyl-1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-2-oxa-4, 7, 10, 13, 16-pentaazaheptadecan-17-yl acetate C126-8 (3 g, crude) as a white solid. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M-60] + found, 570.21.

[0524] Step 8: To a solution of benzyl (2R) -2-hydroxy-3-morpholino-propanoate (1.01 g, 3.81 mmol) in THF (10 mL) was added lithium tert-butoxide (2.2 M, 1.59 mL) at 0 ℃ for 15 min, the reaction mixture was added (S) -11-benzyl-1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-2-oxa-4, 7, 10, 13, 16-pentaazaheptadecan-17-yl acetate C126-8 (2 g, 3.18 mmol) in DMF (10 mL) and THF (10 mL) at 0 ℃. Then the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was quenched by AcOH and concentrated in vacuum. The mixture was purified by Prep-HPLC to afford benzyl (11S, 19R) -11-benzyl-1- (9H-fluoren-9-yl) -19- (morpholinomethyl) -3, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-2, 18-dioxa-4, 7, 10, 13, 16-pentaazaicosan-20-oate C126-9 (1.2 g, 1.44 mmol, 45.25%) as a white solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 835.26.

[0525] Step 9: To a solution of benzyl (11S, 19R) -11-benzyl-1- (9H-fluoren-9-yl) -19- (morpholinomethyl) -3, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-2, 18-dioxa-4, 7, 10, 13, 16-pentaazaicosan-20-oate C126-9 (1.1 g, 1.16 mmol, TFA) in DMF (11 mL) was added Pd / C (98.79 mg, 92.83 μmol, 10%purity) under N2 atmosphere. Degassed and then refilled with H2 over 3 times. Then the mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h under H2 balloon. After completion, the reaction mixture was filtered and concentrated under reduced pressure to afford (11S, 19R) -11-benzyl-1- (9H-fluoren-9-yl) -19- (morpholinomethyl) -3, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-2, 18-dioxa-4, 7, 10, 13, 16-pentaazaicosan-20-oic acid C126-10 (995 mg, crude) as a white solid. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 745.31.

[0526] Step 10: To a solution of exatecan (510 mg, 959.45 μmol, MS) and (11S, 19R) -11-benzyl-1- (9H-fluoren-9-yl) -19- (morpholinomethyl) -3, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-2, 18-dioxa-4, 7, 10, 13, 16-pentaazaicosan-20-oic acid C126-10 (987.63 mg, 1.15 mmol, TFA) in DMF (19 mL) was added DIEA (744.00 mg, 5.76 mmol, 1.00 mL) and HATU (470.57 mg, 1.25 mmol) at 0℃. Then the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure to afford (9H-fluoren-9-yl) methyl ( (2R, 10S) -10-benzyl-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -2- (morpholinomethyl) -1, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-3-oxa-5, 8, 11, 14-tetraazahexadecan-16-yl) carbamate C126-11 (1.12 g, crude) as a yellow solid. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 1162.36.

[0527] Step 11: To a solution of (9H-fluoren-9-yl) methyl ( (2R, 10S) -10-benzyl-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -2- (morpholinomethyl) -1, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-3-oxa-5, 8, 11, 14-tetraazahexadecan-16-yl) carbamate C126-11 (1.12 g, 963.67 μmol) in DMF (19 mL) was added diethylamine (704.80 mg, 9.64 mmol) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC to afford (R) -2- ( ( (S) -13-amino-7-benzyl-3, 6, 9, 12-tetraoxo-2, 5, 8, 11-tetraazatridecyl) oxy) -N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -3-morpholinopropanamide C126-12 (660 mg, 702.14 μmol, 72.86%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 940.35.

[0528] Step 12: To a solution of (S) -32- (2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carboxamido) -26-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-27-azatritriacontan-33-oic acid C126-5 (18.65 mg, 25.73 μmol) and (R) -2- ( ( (S) -13-amino-7-benzyl-3, 6, 9, 12-tetraoxo-2, 5, 8, 11-tetraazatridecyl) oxy) -N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -3-morpholinopropanamide C126-12 (30 mg, 25.73 μmol, 2TFA) in DMF (0.5 mL) was added DIEA (16.63 mg, 128.64 μmol, 22.41 μL) and HATU (11.65 mg, 30.87 μmol) at 0℃. Then the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion, the mixture was purified by Prep-HPLC to afford N- ( (32S, 41S, 49R) -41-benzyl-50- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -49- (morpholinomethyl) -26, 33, 36, 39, 42, 45, 50-heptaoxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 48-nonaoxa-27, 34, 37, 40, 43, 46-hexaazapentacontan-32-yl) -2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carboxamide C126 (13.2 mg, 7.79 μmol, 30.29%) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M / 2+H] + found, 823.88.

[0529] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.40 (s, 2H) , 9.12 (d, J = 7.5 Hz, 1H) , 8.74 (s, 1H) , 8.43-8.32 (m, 2H) , 8.13 (d, J = 3.6 Hz, 1H) , 8.00 (s, 1H) , 7.85 –7.75 (m, 2H) , 7.33 (s, 1H) , 7.27 –7.11 (m, 6H) , 6.55 (s, 1H) , 5.68-5.60 (m, 1H) , 5.42 (s, 2H) , 5.28-5.16 (m, 2H) , 4.79 –4.40 (m, 4H) , 3.78 –3.00 (m, 55H) , 2.79 –2.68 (m, 2H) , 2.39 (s, 3H) , 2.30-2.18 (m, 5H) , 1.95 –1.62 (m, 5H) , 1.43 –1.32 (m, 4H) , 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0530] Method B6: Synthesis of C129

[0531] Step 1: To a stirred solution of (R) -2- ( ( (S) -13-amino-7-benzyl-3, 6, 9, 12-tetraoxo-2, 5, 8, 11-tetraazatridecyl) oxy) -N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -3-morpholinopropanamide C126-12 (80 mg, 75.90 μmol, TF) in DMF (1 mL was added 2, 6-lutidine (24.40 mg, 227.70 μmol) at 25 ℃, then the reaction mixture was added 2-bromoacetyl bromide C129-1 (30.64 mg, 151.80 μmol) in THF (0.1 mL) under N2 at 0℃ and the reaction mixture was stirred at 0℃ for 30 min. After completion, the crude product was purified by Prep-HPLC to give the desired product (R) -2- ( ( (S) -7-benzyl-16-bromo-3, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-2, 5, 8, 11, 14-pentaazahexadecyl) oxy) -N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -3-morpholinopropanamide C129 (25.1 mg, 31.17%yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 1060.25.

[0532] 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.85 (s, 1H) , 8.91 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 8.82 –8.74 (m, 1H) , 8.53 (t, J = 5.7 Hz, 1H) , 8.39 –8.31 (m, 1H) , 8.19 –8.11 (m, 2H) , 7.81 (d, J = 10.8 Hz, 1H) , 7.34 (s, 1H) , 7.26 –7.17 (m, 5H) , 6.55 (s, 1H) , 5.64 (dd, J = 9.9, 4.4 Hz, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.22 (s, 2H) , 4.78 (dd, J = 10.2, 6.3 Hz, 1H) , 4.64 (dd, J = 10.3, 6.8 Hz, 1H) , 4.58 –4.49 (m, 1H) , 4.46 –4.42 (m, 1H) , 4.08 –3.93 (m, 2H) , 3.92 (s, 2H) , 3.76 –3.72 (m, 7H) , 3.61 –3.57 (m, 1H) , 3.24 –3.16 (m, 5H) , 3.05 –2.98 (m, 1H) , 2.81 –2.70 (m, 1H) , 2.53 –2.51 (m, 1H) , 2.40 (d, J = 1.9 Hz, 3H) , 2.24 –2.18 (m, 2H) , 1.89 –1.83 (m, 2H) , 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0533] Method B7: Synthesis of C130

[0534] STEP 1: To a solution of 4-methylsulfanylbenzoic acid (C130-1) (4.6 g, 27.35 mmol) in DCM (50 mL) was added DIEA (10.60 g, 82.04 mmol, 14.29 mL) and HATU (11.44 g, 30.08 mmol) at room temperature. The reaction mixture was stirred at room temperature for 0.5 h. Then tert-butyl piperidine-4-carboxylate (C130-1a) (6.08 g, 32.82 mmol) was added to the reaction mixture and the mixture was stirred for 16 h. After completion, the mixture was diluted with water (50 mL) , exacted with EtOAc (100 mL*3) . The combined organic layer was washed with brine, dried by Na2SO4 and concentrated under reduced pressure. The crude mixture was purified by column chromatography on a silica gel to afford tert-butyl-1- (2-methylsulfanylpyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carboxylate (C130-2) (7.8 g, 23.12 mmol, 84.5%yield) as a white solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 338.15

[0535] STEP 2: To a solution of tert-butyl-1- (2-methylsulfanylpyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carboxylate (C130-2) (7.8 g, 23.12 mmol) in DCM (80 mL) was added TFA (2.64 g, 23.12 mmol, 40 mL) at 0 ℃. The reaction mixture was stirred at 0 ℃ for 30 min and stirred at room temperature for 1.5 h. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure to give 1- (2-methylsulfanylpyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carboxylic acid (C130-3) (6.5 g) as a crude product. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 282.10

[0536] STEP 3: To a solution of 1- (2-methylsulfanylpyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carboxylic acid (C130-3) (4.5 g, 16.00 mmol) in DCM (45 mL) was added DIEA (12.40 g, 95.97 mmol, 16.72 mL) and HATU (6.64 g, 17.59 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 0.5 h. Then tert-butyl- (2S) -2-amino-6- (tert-butoxycarbonylamino) hexanoate hydrochloride (C130-3a) (6.50 g, 19.19 mmol) was added to the reaction mixture and the mixture was stirred for 1.5 h. After completion, the mixture was diluted with water (50 mL) , exacted with EtOAc (100 mL*3) . The combined organic layer was washed with brine, dried by Na2SO4 and concentrated under reduced pressure. The crude mixture was purified by column chromatography on a silica gel to afford tert-butyl- (2S) -6- (tert-butoxycarbonylamino) -2- [ [1- (2-methylsulfanylpyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carbonyl] amino] hexanoate (C130-4) (10.8 g) as a crude product. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] +found, 566.29

[0537] STEP 4: To a solution of tert-butyl- (2S) -6- (tert-butoxycarbonylamino) -2- [ [1- (2-methylsulfanylpyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carbonyl] amino] hexanoate (C130-4) (1 g, 1.77 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (201.55 mg, 1.77 mmol, 1 mL) at 0℃. Then the reaction mixture was stirred at 0℃ for 10 min and stirred at room temperature for 1 h. After completion, the mixture was concentrated under reduced pressure to give (2S) -6-amino-2- [ [1- (2-methylsulfanylpyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carbonyl] amino] hexanoic acid (C130-5) (723.86 mg) as a crude product. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 410.18

[0538] STEP 5: To a solution of (2S) -6-amino-2- [ [1- (2-methylsulfanylpyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carbonyl] amino] hexanoic acid (C130-5) (0.53 g, 1.29 mmol) in DMF (5 mL) was added DIEA (1.00 g, 7.77 mmol, 1.35 mL) at 0℃. Then 2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxahexacosan-26-oate (C130-5a) (659.48 mg, 1.29 mmol) was added to the reaction mixture and stirred at room temperature for 1 h. After completion, the mixture was purified by Pre-hplc to afford (S) -32- (1- (2- (methylthio) pyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carboxamido) -26-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-27-azatritriacontan-33-oic acid (C130-6) (522 mg, 649.29 μmol, 50.2%yield) as a white solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 804.40

[0539] STEP 6: To a solution of (S) -32- (1- (2- (methylthio) pyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carboxamido) -26-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-27-azatritriacontan-33-oic acid (C130-6) (0.47 g, 584.61 μmol) in CH3CN (10 mL) and H2O (3 mL) was added H2O2 (265.10 mg, 2.34 mmol, 30%purity) and Na2WO4·2H2O (9.64 mg, 29.23 μmol) . The mixture was heated to 70 ℃ and stirred for 1 h. After completion, the mixture was purified by Pre-HPLC to afford (S) -32- (1- (2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carboxamido) -26-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-27-azatritriacontan-33-oic acid (C130-7) (260 mg, 311.02 μmol, 53.20%yield) as colorless oil. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 836.39

[0540] STEP 7: To a solution of 4, 4-dimethylpiperidine (C130-8a) (0.4 g, 3.53 mmol) in 1, 4-dioxane (4 mL) was added benzyl oxirane-2-carboxylate (C130-8b) (692.59 mg, 3.89 mmol) . Then the reaction mixture was stirred at 60 ℃ for 16 h. After completion, the mixture was concentrated in vacuo and purified by column chromatography on a silica gel to afford benzyl (2R) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2-hydroxy-propanoate (C130-8) (0.473 g, 1.62 mmol, 45.9%yield) as colorless oil. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 292.29

[0541] STEP 8: To a solution of benzyl (2R) -3- [3, 3-dimethylbutyl (methyl) amino] -2-hydroxy-propanoate (C130-8) (372.89 mg, 1.27 mmol) in THF (4 mL) was added t-BuOLi (2.2 M, 529.55 μL) at 0 ℃. The mixture was stirred at 0 ℃ for 20 min and then [ [ (2S) -2- [ [ (2S) -2- (9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino) -3-methyl-butanoyl] amino] propanoyl] amino] methyl acetate (C130-8c) (0.51 g, 1.06 mmol) in DMF (3 mL) and THF (3 mL) was added to the reaction mixture, and the reaction mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion, the reaction mixture was quenched by AcOH, then the mixture was concentrated in vacuo and purified by Pre-HPLC to afford benzyl (2R) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2- [ [ [ (2S) -2- [ [ (2S) -2- (9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino) -3-methyl-butanoyl] amino] propanoyl] amino] methoxy] propanoate (C130-9) (428 mg, 600.39 μmol, 56.7%yield) as a white solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 713.32.

[0542] STEP 9: To a solution of benzyl (2R) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2- [ [ [ (2S) -2- [ [ (2S) -2- (9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino) -3-methyl-butanoyl] amino] propanoyl] amino] methoxy] propanoate (C130-9) (0.4 g, 561.11 μmol) in DMF (6 mL) was added Pd / C (38 mg, 312.89 μmol, 10%purity) under N2 atmosphere. The reaction was exchanged with H2 for three times and stirred at r. t for 1 h under N2 balloon. After completion, the mixture was filtered and purified by Pre-HPLC to afford (2R) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2- [ [ [ (2S) -2- [ [ (2S) -2- (9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino) -3-methyl-butanoyl] amino] propanoyl] amino] methoxy] propanoic acid (C130-10) (0.2 g, 321.16 μmol, 57.2%yield) as a white solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 623.38

[0543] STEP 10: To a mixture of (2R) -3- (4, 4-dimethyl-1-piperidyl) -2- [ [ [ (2S) -2- [ [ (2S) -2- (9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino) -3-methyl-butanoyl] amino] propanoyl] amino] methoxy] propanoic acid (C130-10) (0.18 g, 289.04 μmol) and exatecan (161.32 mg, 303.49 μmol, MS) in DMF (6 mL) was added DIEA (186.78 mg, 1.45 mmol, 251.72 μL) and HATU (119.95 mg, 317.94 μmol) at 0℃. The reaction was stirred at 0℃ for 1 h. After completion, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure to afford (9H-fluoren-9-yl) methyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( ( ( (R) -3- (4, 4-dimethylpiperidin-1-yl) -1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) oxy) methyl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) carbamate (C130-11) (300.65) as a crude product. The crude product was used directly for the next step without further purification. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 1040.86

[0544] STEP 11: To a solution of (9H-fluoren-9-yl) methyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( ( ( (R) -3- (4, 4-dimethylpiperidin-1-yl) -1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) oxy) methyl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) carbamate (C130-11) (0.33 g, 317.25 μmol) in DMF (6 mL) was added diethylamine (139.22 mg, 1.90 mmol) . The reaction was stirred at r. t for 2 h. After completion, the mixture was purified by Pre-HPLC to afford (S) -2-amino-N- ( (S) -1- ( ( ( ( (R) -3- (4, 4-dimethylpiperidin-1-yl) -1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) oxy) methyl) amino) -1-oxopropan-2-yl) -3-methylbutanamide (C130-12) (115 mg, 140.60 μmol, 44.32%yield) as a yellow solid.

[0545] LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 818.42

[0546] STEP 12: To a solution of (S) -32- (1- (2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carboxamido) -26-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-27-azatritriacontan-33-oic acid (C130-7) (40.00 mg, 47.85 μmol) and (S) -2-amino-N- ( (S) -1- ( ( ( ( (R) -3- (4, 4-dimethylpiperidin-1-yl) -1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) oxy) methyl) amino) -1-oxopropan-2-yl) -3-methylbutanamide (C130-12) (39.04 mg, 47.85 μmol) in DMF (1 mL) was added DIEA (24.74 mg, 191.40 μmol, 33.34 μL) , HATU (19.86 mg, 52.63 μmol) at 0 ℃. The reaction mixture was stirred at 0 ℃ for 10 min and stirred at r. t for 1 h. After completion, the mixure was purified by Pre-hplc to afford N- ( (32S, 35S, 38S, 43R) -43- ( (4, 4-dimethylpiperidin-1-yl) methyl) -44- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -35-isopropyl-38-methyl-26, 33, 36, 39, 44-pentaoxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 42-nonaoxa-27, 34, 37, 40-tetraazatetratetracontan-32-yl) -1- (2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carbonyl) piperidine-4-carboxamide (C130) (9 mg, 5.50 μmol, 11.50%yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M / 2+H] + found, 818.64

[0547] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.14 (s, 2H) , 8.79 (s, 1H) , 8.52 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 7.98 (t, J = 2.5 Hz, 2H) , 7.80 (d, J = 11.1 Hz, 2H) , 7.31 (s, 1H) , 6.55 (s, 1H) , 5.48 –5.37 (m, 2H) , 5.37 –5.17 (m, 2H) , 4.64 (s, 1H) , 4.57 –4.35 (m, 2H) , 4.26 –4.05 (m, 4H) , 3.63 –3.40 (m, 41H) , 3.23 (s, 4H) , 2.97 (s, 4H) , 2.40 (d, J = 1.9 Hz, 4H) , 2.30 –2.07 (m, 6H) , 1.83 (d, J = 8.3 Hz, 4H) , 1.59 (s, 6H) , 1.26 –1.15 (m, 7H) , 0.99 (s, 3H) , 0.86 (t, J = 7.3 Hz, 3H) , 0.68 (q, J = 7.6 Hz, 12H) .

[0548] Method B8: Synthesis of C119

[0549] Step 1: To a stirred solution of (S) -2-amino-N- ( (S) -1- ( ( (R) -3-azido-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) -3-methylbutanamide C119-1 (150 mg, 180.34 μmol, TF) in DMF (2 mL) , the reaction was added 1- (2- (methylsulfonyl) pyrimidin-5-yl) -1-oxo-5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26-octaoxa-2-azanonacosan-29-oic acid C119-2 (124.12 mg, 198.37 μmol) , then was added DIEA (93.23 mg, 721.35 μmol, 125.65 μL) and HATU (88.45 mg, 234.44 μmol) the reaction mixture was stirred at 25℃ for 1 h. After completion, the crude product was purified by Prep-HPLC to give desired product N- ( (29S, 32S, 35R) -35- (azidomethyl) -36- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -29-isopropyl-32-methyl-27, 30, 33, 36-tetraoxo-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24-octaoxa-28, 31, 34-triazahexatriacontyl) -2- (methylsulfonyl) pyrimidine-5-carboxamide C119-3 (88.6 mg, 37.07%yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M+H] + found, 1326.44.

[0550] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.37 (s, 2H) , 9.12 (t, J = 5.4 Hz, 1H) , 8.56 (d, J = 8.3 Hz, 1H) , 8.40 (d, J = 8.1 Hz, 1H) , 8.06 (d, J = 6.2 Hz, 1H) , 7.82 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.44 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.33 (s, 1H) , 5.62 –5.52 (m, 1H) , 5.46 (m, 2H) , 5.28 (d, J = 7.7 Hz, 2H) , 4.50 (d, J = 7.9 Hz, 1H) , 4.21 –4.13 (m, 1H) , 4.06 (dd, J = 8.7, 7.0 Hz, 1H) , 3.65 (d, J = 6.1 Hz, 2H) , 3.60 –3.51 (m, 9H) , 3.51 –3.44 (m, 31H) , 2.41 (d, J = 6.8 Hz, 4H) , 2.25 (m, 2H) , 2.09 (s, 1H) , 1.87 (m, 2H) , 1.61 (d, J = 6.8 Hz, 1H) , 1.17 (d, J = 7.0 Hz, 3H) , 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H) , 0.70 (dd, J = 13.8, 6.7 Hz, 6H) .

[0551] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0552] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0553] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0554] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0555] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0556] 2.6-3.5 min: 5%B

[0557] Flow rate: 1 mL / min

[0558] Column temperature: 25 oC

[0559] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0560] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0561] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0562] Flow rate: 35 mL / min

[0563] Column temperature: 25 oC

[0564] Method B9: Synthesis of C125

[0565] Step 1: To a solution of 1- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3-oxo-7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28-octaoxa-4-azahentriacontan-31-oic acid (C125-2) (32.15 mg, 54.26 μmol) and 2- ( ( (S) -13-amino-7-benzyl-3, 6, 9, 12-tetraoxo-2, 5, 8, 11-tetraazatridecyl) oxy) -N- ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) -3-morpholinopropanamide C125-1 (51 mg, 54.26 μmol) in DMF (1.6 mL) was added DIEA (17.53 mg, 135.64 μmol, 23.63 μL) at 0℃, then was added HATU (24.56 mg, 65.11 μmol) at 0℃. The mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. The mixture was purified by Prep-HPLC (FA) to afford N- ( (10S) -10-benzyl-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -2- (morpholinomethyl) -1, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-3-oxa-5, 8, 11, 14-tetraazahexadecan-16-yl) -1- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) propanamido) -3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24-octaoxaheptacosan-27-amide C125 (39.7 mg, 25.24 μmol, 46.52%yield) as a yellow solid. LCMS-ESI (m / z) : [M / 2+H] + found, 757.59.

[0566] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.80 (s, 1H) , 9.01 –8.66 (m, 2H) , 8.43-8.34 (m, 1H) , 8.20-8.10 (m, 8.8 Hz, 2H) , 8.02 (s, 1H) , 7.82 (dd, J = 11.0, 4.8 Hz, 1H) , 7.34 (s, 1H) , 7.28 –7.17 (m, 5H) , 7.01 (s, 2H) , 6.56 (s, 1H) , 5.62 (s, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.36 –5.14 (m, 2H) , 4.70-4.58 (m, 4H) , 3.97 (s, 2H) , 3.78 –3.55 (m, 13H) , 3.53 –3.46 (m, 30H) , 3.38 –3.35 (m, 3H) , 3.26 –3.11 (m, 6H) , 3.03 –2.98 (m, 1H) , 2.78 (m, J = 23.6, 13.7 Hz, 1H) , 2.42 –2.30 (m, 7H) , 2.22 (s, 2H) , 1.87 (m, J = 5.9 Hz, 2H) , 0.88 (t, J = 7.1 Hz, 3H) .

[0567] Test Method: Titank C18 3 μm 50*2.1 mm

[0568] Mobile phase: A: 0.1%HCOOH in water; B: acetonitrile

[0569] Separation method: 0-0.2 min: 5%B

[0570] 0.2-2.5 min: 5%B～95%B

[0571] 2.5-2.6 min: 95%B～5%B

[0572] 2.6-3.5 min: 5%B

[0573] Flow rate: 1 mL / min

[0574] Column temperature: 25 oC

[0575] Prep-HPLC Method: YMC Triart C-18 30*250 mm 10 μm

[0576] Mobile phase: A: 0.1%TFA in water; B: acetonitrile

[0577] Separation method: 0-25 min: 5%B～95%B

[0578] Flow rate: 35 mL / min

[0579] Column temperature: 25 oC

[0580] The compounds in table 2 were synthesized as above.

[0581] Table 2. Linker-payloads provided by this invention

[0582] Method C: Preparation of ADCs

[0583] Method C1: Preparation of antibody-C67

[0584] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (50 mM, 2.67 μL, 133.34 nmol, 20 eq of Ab) was added to a histidine-buffered aqueous solution (0.025 M histidine-buffered aqueous solution with pH=6.0) of antibody (Ab, 0.2 ml, 5 mg / ml, 6.67 nmol, produced in Reference Example 1) at 37℃. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hours. A Topo I linker payload C67 (20 eq) , 10 mM dissolved in DMSO, was then added in one portion and the mixture was incubated in air bath at 30 ℃ with gently rotation for another 60 mins. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. The reaction solution was desalted and purified with a Zeba spin desalting column (MWCO: 7K, 2 ml, Cat#89890) conditioned with PBS-buffered aqueous solution pH=7.4 to obtain the PBS-buffered solution of the exemplary product antibody-C67 (2.99 mg / ml, 0.2 ml) as shown in above formula. The drug antibody ratio (DAR) was determined by liquid chromatography mass spectrometry method. The purity and hydrophobicity of antibody-C67 were measured by size exclusion chromatography (SEC) and hydrophobic interaction chromatography (HIC) , respectively.

[0585] Antibody (Ab) in Method C was produced in accordance with a method known in the art. The information for the sequence of the antibody used in method C is shown in Table 4.

[0586] Method C2: Preparation of antibody-C9

[0587] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (50 mM, 8 μL, 400 nmol, 20 eq of Ab) was added to a PBS-buffered aqueous solution with pH= 7.4, containing 0.001M EDTA) of antibody (Ab, 0.6 ml, 5 mg / ml, 33.3 nmol, produced in Reference Example 1) at 37℃. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hours. A Topo I linker payload C9 (20 eq) , 10 mM dissolved in DMSO, was then added in one portion and the mixture was incubated in air bath at 30 ℃ with gently rotation for another 60 mins. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. The reaction solution was purified using a  200 Increase 10 / 300 GL column (Cytiva, Cat#28-9909-44) with PBS-buffered aqueous solution with pH=7.4 as elution phase. The main eluted fractions were pooled together and concentrated using MilliporeSigmaTM AmiconTM Ultra-4 Centrifugal Filter (MWCO: 10K, 4 ml, Cat#UFC801024) . The exemplary product antibody-C9 (4.1 mg / ml, 0.4 ml) as shown above was received. The DAR was determined by liquid chromatography mass spectrometry method. The purity and hydrophobicity of antibody-C9 were measured by SEC and HIC, respectively.

[0588] Method C3: Preparation of antibody-C59

[0589] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (50 mM, 13.3 μL, 666.5 nmol, 20 eq of Ab) was added to a PBS-buffered aqueous solution with pH= 7.4, containing 0.001M EDTA) of antibody (Ab, 1 ml, 5 mg / ml, 20 nmol) at 37℃. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hours. A Topo I linker payload C59 (20 eq) , 10 mM dissolved in DMSO, was then added in one portion and the mixture was incubated in air bath at 30 ℃ with gently rotation for another 60 mins. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. The reaction solution was purified using a 200 Increase 10 / 300 GL column (Cytiva, Cat#28-9909-44) with PBS-buffered aqueous solution with pH=7.4 as elution phase. The main eluted fractions were pooled together and concentrated using MilliporeSigmaTM AmiconTM Ultra-4 Centrifugal Filter (MWCO: 10K, 4 ml, Cat#UFC801024) . The exemplary product antibody-C59 (4.45 mg / ml, 0.8 ml) as shown above was received. The DAR was determined by liquid chromatography mass spectrometry method. The purity and hydrophobicity of antibody-C59 were measured by SEC and HIC, respectively.

[0590] Method C4: Preparation of antibody-C13

[0591] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (50 mM, 13.3 μL, 666.5 nmol, 20 eq of Ab) was added to a PBS-buffered aqueous solution with pH= 7.4, containing 0.001M EDTA) of antibody (Ab, 1 ml, 5 mg / ml, 20 nmol) at 37℃. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hours. A Topo I linker payload C13 (20 eq) , 10 mM dissolved in DMSO, was then added in one portion and the mixture was incubated in air bath at 30 ℃ with gently rotation for another 60 mins. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. The reaction solution was purified using a  200 Increase 10 / 300 GL column (Cytiva, Cat#28-9909-44) with PBS-buffered aqueous solution with pH=7.4 as elution phase. The main eluted fractions were pooled together and concentrated using MilliporeSigmaTM AmiconTM Ultra-4 Centrifugal Filter (MWCO: 10K, 4 ml, Cat#UFC801024) . The exemplary product antibody-C13 (10.66 mg / ml, 0.3 ml) as shown above was received. The DAR was determined by liquid chromatography mass spectrometry method. The purity and hydrophobicity of antibody-C13 were measured by SEC and HIC, respectively.

[0592] Method C5: Preparation of antibody-C56

[0593] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (50 mM, 1.6 μL, 80 nmol, 20 eq of Ab) was added to Tris-HCl-buffered aqueous solution with pH= 8.0, containing 0.001M EDTA) of antibody (Ab, 0.3 ml, 2 mg / ml, 4 nmol) at 37℃. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hours. A Topo I linker payload C56 (20 eq) , 10 mM dissolved in DMSO, was then added in one portion and the mixture was incubated in air bath at 30 ℃ with gently rotation for another 120 mins. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. The reaction solution was desalted and purified with a Zeba spin desalting column (MWCO: 7K, 2 ml, Cat#89890) conditioned with PBS-buffered aqueous solution with pH=7.4 to obtain the PBS-buffered solution of the exemplary product antibody-C56 (1.15 mg / ml, 0.3 ml) as shown in above formula. The DAR was determined by liquid chromatography mass spectrometry method. The purity and hydrophobicity of antibody-C56 were measured by SEC and HIC, respectively.

[0594] Method C6: Preparation of antibody-C52

[0595] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (50 mM, 1.6 μL, 80 nmol, 20 eq of Ab) was added to Tris-HCl-buffered aqueous solution with pH= 8.0, containing 0.001M EDTA) of antibody (Ab, 0.3 ml, 2 mg / ml, 4 nmol) at 37℃. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hours. A Topo I linker payload C52 (20 eq) , 10 mM dissolved in DMSO, was then added in one portion and the mixture was incubated in air bath at 30 ℃ with gently rotation for another 120 mins. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. The reaction solution was desalted and purified with a Zeba spin desalting column (MWCO: 7K, 2 ml, Cat#89890) conditioned with PBS-buffered aqueous solution with pH=7.4 to obtain the PBS-buffered solution of the exemplary product antibody-C52 (1.15 mg / ml, 0.3 ml) as shown in above formula. The DAR was determined by liquid chromatography mass spectrometry method. The purity and hydrophobicity of antibody-C52 were measured by SEC and HIC, respectively.

[0596] Method C7: Preparation of antibody-C54

[0597] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (50 mM, 1.6 μL, 80 nmol, 20 eq of Ab) was added to Tris-HCl-buffered aqueous solution with pH= 8.0, containing 0.001M EDTA) of antibody (Ab, 0.3 ml, 2 mg / ml, 4 nmol) at 37℃. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hours. A Topo I linker payload C54 (30 eq) , 10 mM dissolved in DMSO, was then added in one portion and the mixture was incubated in air bath at 30 ℃ with gently rotation for another 120 mins. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. The reaction solution was desalted and purified with a Zeba spin desalting column (MWCO: 7K, 2 ml, Cat#89890) conditioned with PBS-buffered aqueous solution with pH=7.4 to obtain the PBS-buffered solution of the exemplary product antibody-C54 (1.11 mg / ml, 0.3 ml) as shown in above formula. The DAR was determined by liquid chromatography mass spectrometry method. The purity and hydrophobicity of antibody-C54 were measured by SEC and HIC, respectively.

[0598] Method C8: Preparation of antibody-C53

[0599] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (50 mM, 1.6 μL, 80 nmol, 20 eq of Ab) was added to Tris-HCl-buffered aqueous solution with pH= 8.0, containing 0.001M EDTA) of antibody (Ab, 0.3 ml, 2 mg / ml, 4 nmol) at 37℃. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hours. A Topo I linker payload C53 (30 eq) , 10 mM dissolved in DMSO, was then added in one portion and the mixture was incubated in air bath at 30 ℃ with gently rotation for another 120 mins. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. The reaction solution was desalted and purified with a Zeba spin desalting column (MWCO: 7K, 2 ml, Cat#89890) conditioned with PBS-buffered aqueous solution with pH=7.4 to obtain the PBS-buffered solution of the exemplary product antibody-C53 (1.11 mg / ml, 0.3 ml) as shown in above formula. The DAR was determined by liquid chromatography mass spectrometry method. The purity and hydrophobicity of antibody-C53 were measured by SEC and HIC, respectively.

[0600] Method C9: Preparation of antibody-C58

[0601] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (50 mM, 1.6 μL, 80 nmol, 20 eq of Ab) was added to Tris-HCl-buffered aqueous solution with pH= 8.0, containing 0.001M EDTA) of antibody (Ab, 0.3 ml, 2 mg / ml, 4 nmol) at 37℃. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hours. A Topo I linker payload C58 (30 eq) , 10 mM dissolved in DMSO, was then added in one portion and the mixture was incubated in air bath at 30 ℃ with gently rotation for another 120 mins. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. The reaction solution was desalted and purified with a Zeba spin desalting column (MWCO: 7K, 2 ml, Cat#89890) conditioned with PBS-buffered aqueous solution with pH=7.4 to obtain the PBS-buffered solution of the exemplary product antibody-C58 (1.32 mg / ml, 0.3 ml) as shown in above formula. The DAR was determined by liquid chromatography mass spectrometry method. The purity and hydrophobicity of antibody-C58 were measured by SEC and HIC, respectively.

[0602] Method C10: Preparation of antibody-C68

[0603] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (50 mM, 1.6 μL, 80 nmol, 20 eq of Ab) was added to Tris-HCl-buffered aqueous solution with pH= 8.0, containing 0.001M EDTA) of antibody (Ab, 0.3 ml, 2 mg / ml, 4 nmol) at 37℃. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hours. A Topo I linker payload C68 (30 eq) , 10 mM dissolved in DMSO, was then added in one portion and the mixture was incubated in air bath at 30 ℃ with gently rotation for another 120 mins. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. The reaction solution was desalted and purified with a Zeba spin desalting column (MWCO: 7K, 2 ml, Cat#89890) conditioned with PBS-buffered aqueous solution with pH=7.4 to obtain the PBS-buffered solution of the exemplary product antibody-C68 (1.53 mg / ml, 0.3 ml) as shown in above formula. The DAR was determined by liquid chromatography mass spectrometry method. The purity and hydrophobicity of antibody-C68 were measured by SEC and HIC, respectively.

[0604] Method C11: Preparation of antibody-C57

[0605] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (50 mM, 1.6 μL, 80 nmol, 20 eq of Ab) was added to Tris-HCl-buffered aqueous solution with pH= 8.0, containing 0.001M EDTA) of antibody (Ab, 0.3 ml, 2 mg / ml, 4 nmol) at 37℃. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hours. A Topo I linker payload C57 (30 eq) , 10 mM dissolved in DMSO, was then added in one portion and the mixture was incubated in air bath at 30 ℃ with gently rotation for another 120 mins. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. The reaction solution was desalted and purified with a Zeba spin desalting column (MWCO: 7K, 2 ml, Cat#89890) conditioned with PBS-buffered aqueous solution with pH=7.4 to obtain the PBS-buffered solution of the exemplary product antibody-C57 (1.25 mg / ml, 0.3 ml) as shown in above formula. The DAR was determined by liquid chromatography mass spectrometry method. The purity and hydrophobicity of antibody-C57 were measured by SEC and HIC, respectively.

[0606] Method C12: Preparation of antibody-C76

[0607] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) )phosphine (50 mM, 1.6 μL, 80 nmol, 20 eq of Ab) was added to Tris-HCl-buffered aqueous solution with pH= 8.0, containing 0.001M EDTA) of antibody (Ab, 0.3 ml, 2 mg / ml, 4 nmol) at 37℃. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hours. A Topo I linker payload C76 (30 eq) , 10 mM dissolved in DMSO, was then added in one portion and the mixture was incubated in air bath at 30 ℃ with gently rotation for another 120 mins. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. The reaction solution was desalted and purified with a Zeba spin desalting column (MWCO: 7K, 2 ml, Cat#89890) conditioned with PBS-buffered aqueous solution with pH=7.4 to obtain the PBS-buffered solution of the exemplary product antibody-C76 (1.84 mg / ml, 0.25 ml) as shown in above formula. The DAR was determined by liquid chromatography mass spectrometry method. The purity and hydrophobicity of antibody-C76 were measured by SEC and HIC, respectively.

[0608] ADC purification by desalting columns: Zeba spin desalting columns (MWCO 7K, 2 ml or 5 ml, Thermo Scientific) were prepared as manufacture instructions. Removed the column’s bottom closure and loosened cap; placed columns into 15 mL conical tubes; centrifuged at 1000xg for 2 mins; Discarded flow-through and replaced the column back into tubes; Added wash buffer on top of the resin; centrifuged device and discarded flow-through. Repeated this step two additional times; Applied ADC samples on top of the resin; centrifuged and retained the flow-through that contained ADCs.

[0609] ADC purification by FPLC: ADC purifications with  200 Increase 10 / 300 GL column (Cytiva, Cat#28-9909-44) were done with Akta pure FPLC purifier system. Sample was loaded to column and washed with 1.1 column volumes of PBS-buffered aqueous solution pH=7.4 at a flow rate 0.75 mL / min. ADC concentration was determined by Nanodrop one, Thermo Fisher Scientific) .

[0610] Drug Antibody Ratio (DAR) by LC-MS: ADC samples (1-5 mg / ml, 10 μl) were incubated with 1 μl of RapidTM PNGase F (New England Biolabs, Cat#P0710S) and 4 μl of DTT (500 mM) at 50 ℃ for 10 mins to release all N-glycans and reduce interchain disulfide bonds. The reacted mixture was diluted in 1: 6 with PBS-buffered aqueous solution pH=7.4. Then the drug antibody ratio (DAR) was analyzed using an 1260 HPLC system linked to a 6230B Time of Flight Mass Spectrometer (Agilent) equipped with a Dual AJS ESI source in the positive ion mode. MS-scans were recorded with a range from 300-3200 m / z. Instrument calibration was performed using ESI calibration mixture (Agilent) . The separation was conducted on an Agilent HPLC RLRP-Scolumn (100A, 5μm, 50x2.1mm) . Samples (5 or 10 μl) were injected to a column and separated by gradient run at 0.5 mL / min with mobile phase: Buffer A, acetonitrile+1%formic acid; Buffer B, water+1%formic acid. Gradient condition was 0-1 min, 5%B-20%B; 1-6 min, 20%B-60%B; 6-7 min, 60B%-90%B, 7-8 min, 90%B; 8-8.5 min, 90%B-25%B; 8.5-10 min, 25%B-5%B; 10-13 min, 5%B. The analysis files were deconvoluted using MassHunter BioConfirm Software 10.0 (Agilent) with maximum entropy algorithm: mass range from 20,000 to 65,000 Daltons; mass step 1.0 Daltons; baseline factor 7.0; peak signal to noise ≥ 30.0. The DAR value was calculated by a MassHunter DAR calculator (Agilent) based on deconvoluted mass signals of unconjugated / conjugated light chains and heavy chains.

[0611] The compounds in table 3 were synthesized as above.

[0612] Table 3. structures, purity and hydrophobicity of ADCs in this invention

[0613] Method C13: Preparation of antibody-C13 and antibody-C117

[0614] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (100 mM in stock, 20 eq of Ab) was added to antibodies in phosphate buffered saline (PBS) pH=7.4. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hrs. The reduced antibodies were diluted with PBS pH=7.4 at a ratio of 1: 1. A Topo I linker payload (10 mM dissolved in DMSO, 20 eq) was then added and the mixture was incubated at room temperature with gently rotation for another 1 hr. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. ADCs were purified using Akta pure fast protein liquid chromatography (FPLC) system.

[0615] Method C14: Preparation of antibody-C126 and antibody-C130

[0616] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (100 mM in stock, 20 eq of Ab) was added to antibodies in phosphate buffered saline (PBS) pH=7.4. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hrs. A Topo I linker payload (10 mM dissolved in DMSO, 20 eq) was then added and the mixture was incubated at room temperature with gently rotation for another 1 hr. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. ADCs were purified using Akta pure FPLC system.

[0617] Method C15: Preparation of antibody-C53 and antibody-C129

[0618] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (100 mM in stock, 20 eq of Ab) was added to antibodies in 1: 1 of PBS pH=7.4 and NaCl-Tris-HCl-buffered aqueous solution with pH= 8.0 (NaCl 25 mM and Tris-HCl 25 mM) . The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hrs. A Topo I linker payload (10 mM dissolved in DMSO, 25 eq) was then added and the mixture was incubated at room temperature with gently rotation for another 1 hr. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload. ADCs were purified using Akta pure FPLC system.

[0619] Method C16: Preparation of antibody-C118

[0620] A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (100 mM in stock, 8 eq of Ab) was added to antibodies in phosphate buffered saline with pH=7.4. The reaction solution was incubated at room temperature for 4 hrs. The reduced antibody was diluted with Tris-HCl-buffered aqueous solution with pH= 8.0 (100 mM in stock) at a ratio of 1: 1. The final concentration of Tris-HCl was 50 mM. A Topo I linker payload (10 mM dissolved in DMSO, 25 eq) was then added and the mixture was incubated at room temperature with gently rotation for another 1 hr. Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of linker payload.

[0621] Method C17: Prepareation of antibody-Deruxtecan

[0622] Reference ADCs with deruxtecan were prepared as the following procedure. A formulated aqueous solution of tris (2-carboxyethyl) phosphine (100 mM in stock, 20 eq of Ab) was added to antibodies in phosphate buffered saline (PBS) pH=7.4. The reaction solution was placed in a water bath and incubated at 37℃ for 2 hrs. The deruxtecan (10 mM dissolved in DMSO, 20 eq) was then added and the mixture was incubated at room temperature with gently rotation for another 1 hr.Up to 15%of DMSO was added to improve the solubility of deruxtecan. ADCs were purified using Akta pure FPLC system.

[0623] ADC purification by FPLC

[0624] ADC purifications with HiLoadTM 16 / 600 SuperdexTM 200 pg column (Cytiva, Cat#28989335) were performed on Akta pure FPLC system to obtain the PBS-buffered solution of ADCs. Samples were loaded to the column and washed with 1.1 column volumes of PBS-buffered aqueous solution pH=7.4 at a flow rate 1.5 mL / min.

[0625] Drug Antibody Ratio (DAR) by LC-MS

[0626] ADC samples were diluted with PBS pH=7.4 to a concentration about 0.5 mg / ml. Then the drug antibody ratio (DAR) was analyzed using an 1260 HPLC system linked to a 6230B Time of Flight Mass Spectrometer (Agilent) equipped with a Dual AJS ESI source in the positive ion mode. MS-scans were recorded with a range from 300-3200 m / z. Instrument calibration was performed using ESI calibration mixture (Agilent) . The separation was conducted on a Waters BioResolveTM RP mAb column (Polyphenyl,  2.7 μM, 2.1x150 mm) . Samples (10 μl) were injected to the column and separated by a gradient run at 0.3 mL / min with mobile phase: Buffer A, acetonitrile+1%formic acid; Buffer B, water+1%formic acid. Gradient condition was 0-2 min, 25%B; 2-11 min, 25%B-50%B; 11-12 min, 50%B, 12-13 min, 50%-90%B; 13-14 min, 90%B; 14-15 min, 90%B-25%B. The MS analysis files were deconvoluted using MassHunter BioConfirm Software 10.0 (Agilent) with maximum entropy algorithm: mass range from 20,000 to 65,000 Daltons; mass step 1.0 Daltons; baseline factor 7.0; peak signal to noise ≥ 30.0. The DAR value was calculated by a MassHunter DAR calculator (Agilent) based on deconvoluted mass signals of unconjugated / conjugated light chains and heavy chains.

[0627] Aggregation analysis by HPLC

[0628] The aggregation or purity of ADCs was analyzed by size exclusion chromatography (SEC) using Agilent 1260 HPLC system. ADCs about 1 mg / mL were injected to the G3000SWXL HPLC Column (Cat#808541) and separated by isocratic run with 0.1 M Na2SO4, 0.1M sodium phosphate, pH=6.7, 0.05%NaN3 at a flow rate 1 mL / min or to the XbridgeTM premier protein SEC column ( 2.5 μM, 7.8x300 mm, PN: 186009962) and separated with 10%ACN+90%20 mM sodium phosphate and 100 mM potassium chloride pH=7.0.

[0629] Hydrophobicity analysis by HPLC

[0630] The hydrophobicity analysis of ADCs was analyzed by hydrophobic interaction chromatography (HIC) with AdvanceBio HIC 4.6x100 mm column (PN#685975-908, Agilent) using Agilent 1260 HPLC system. ADCs about 1 mg / mL was injected to the column (injection volume 15 μl) and separated by gradient run at 0.5 mL / min with mobile phase: Buffer A, 1.5 M Ammonium Sulfate, 50 mM Sodium Phosphate pH=7.0, 5%IPA; Buffer B: 50 mM Sodium Phosphate pH=7.0, 20%IPA. Gradient condition was 0-1 min, 0%B; 1-20 min, 0%B-100%B, 20-25 min, 100B%, 25-30 min, 100%B-0%B; 30-35 min, 0%B.

[0631] ADC concentration measurement

[0632] ADC concentration was measured using PierceTM BCA Protein Assay Kits (Cat#A55864, Thermo Fisher Scientific) with bovine gamma globulin as a standard (Cat#23212, Thermo Fisher Scientific) .

[0633] Antibody (Ab) in Method C was produced in accordance with a method known in the art. The information for the sequence of the antibody used in method C is shown in Table 4. Motavizumab also as MOTA, a monoclonal antibody against respiratory syncytial virus, refering to US8852608B2.

[0634] Table 4. heavy chain and light chain sequence of antibodies used in boiological assays

[0635] ADCs provided by this invention were synthesized as above mentioned methods of Method A, Mehod B and Method C, some of them were used in biological assays, for example, EHW1-C53 was prepared by method C8.

[0636] BIOLOGICAL ASSAYS

[0637] Example 1: In-vitro cytotoxicity and developability of payloads

[0638] In-vitro cytotoxicity of payloads was evaluated using the protocol as instructed by the CellTiter-Glo kit (Promega, Cat. No G7573) . SKBR3 Cells (human breast cancer cell line, ATCC) , NCI-H1975 cells (non-small cell lung cancer cell line, NCI) , HCC827 (ATCC) , NCI-H460 (NCI) cells were tested. Briefly, 2x103 cells in 50 μL RPMI medium with 10%FBS were added to each well of white flat bottom 96-well plate (Corning, Costar, Fisher Scientific, Waltham, MA) . Plates were incubated at 37 ℃, 5%CO2 overnight. Next day, the test compounds in DMSO (10 mM) were diluted to a stock 2000 nM in RPMI+10%FBS. Treatments were then serially diluted 1: 5 in RPMI+10%FBS+0.2%DMSO. 50 μL of this series was added to each well in triplicate, resulting test compounds in a range from 2.56 pM to 2000 nM. Media-only controls were also included. Plates were incubated for another 72 hours. At the end of the incubation, 100 μl of substrate solution (Promega, Madison, WI) was added to each well. Luminescence was measured using an EnVision Multilabel pate reader (Perkin Elmer, Waltham, MA) . Data were analyzed and plotted using GraphPad Prism software (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA) . Dxd (MedChemExpress, 1599440-33-1) , SN-38 (Medichemexpress, 86639-52-3) , MK (CAS 3031998-81-6, prepared by a method disclosed in WO2024049931A1) were used as references.

[0639] Multiple new compounds were tested in SKBR3, NCI-H1975, HCC827 cells, the results as shown in Table 5, new compounds show better or comparable cytotoxicity to DXd and SN-38 in SKBR3, NCI-H1975, HCC827 and NCI-H460 cells. Among the new compounds, as shown in Figure 2, C115 show better in-vitro cytotoxicity compared with Dxd in SKBR3 (Figure 2B) , NCI-H1975 (Figure 2A) , NCI-H460 cells (Figure 2C) ; C110, C127 show better cytotoxicity compared with Dxd in NCI-H1975 and SKBR3 cells, as shown in figure 1, C11 especially show unexpected superior in vitro cytotoxicity compared with MK in SKBR3 (Figure 1A) , NCI-1975 (Figure 1B) and NCI-H460 cells (Figure 1C) .

[0640] Table 5. In-vitro Cytotoxicity of Payloads (IC50, nM)

[0641] Note: “- “Represents no relevant experimental data

[0642] Refer to the aforementioned experimental method, multiple heterocyclic-substituted compounds with the scaffold structure below were tested, but not all showed promising cytotoxicity or developmental value. As indicated in Table 6, C31 show better in-vitro cytotoxicity compared with other compounds which comprise heterocyclic ring at R1 or R2, especially, C31 exhibited unexpected superior in vitro cytotoxicity in terms of when O on morpholine ring of C31 was replaced with N, the IC50 was 48.4nM in SKBR3 cells and 61.3nM in NCI-H1975 cells, the in-vitro cytotoxicity decreased a lot compared with C31.

[0643] Table 6. In-vitro Cytotoxicity of Payloads (IC50, nM)

[0644] Example 2: solubility and stability of payloads

[0645] Since solubility and stability of payloads are essential to ADCs’ conjugation efficiency and developability, we tested our payloads for solubility in PBS pH=7.4, stability in human plasma, stability in human liver microsomes and %unbound of protein binding.

[0646] The stock solutions of test compound (s) and control compounds (progesterone and diclofenac) were prepared in DMSO at the concentrations of 10 mM. 15 μL of stock solution (10 mM) of each sample was placed in order into their proper 96-well rack. 485 μL of buffer was added into each vial of the cap-less solubility sample plate. The assay was performed in duplicate. Add one stir stick to each vial and seal using a molded PTFE / Silicone plug. Then the solubility sample plate was transferred to the Eppendorf Thermomixer Comfort plate shaker and shake at 25℃ at 1100 rpm for 2 hours. After completion of the 2 hours, plugs were removed and the stir sticks were removed using a big magnet, the samples from the solubility sample plate were transferred into the filter plate. Using the Vacuum Manifold, all the samples were filtered. Aliquot 5 μL filtrate and 5 μL DMSO followed by addition of 490 μL of a mixture of H2O and methyl alcohol containing internal standard (1: 1) as 100 fold diluted samples. Then 20 μL of 100 fold diluted samples are further diluted by addition of 180 μL of a mixture of H2O and methyl alcohol containing internal standard (1: 1) as 1000 fold diluted samples. A certain proportion of a mixture of H2O and methyl alcohol containing internal standard (1: 1) was used to dilute the diluent according to the peak shape. The dilution factor was changed according to the solubility values and the samples were evaluated by LC-MS / MS analysis. Solubility values of the test compound and control compound were calculated as follows:

[0647] DF means the dilution factor. Any value of the compounds that was not within the specified limits was rejected and the experiment was repeated.

[0648] As shown in Table 7, tested payloads showed much better solubility (>62 μM) compared to DXd (9.26 μM) . Furthermore, new payloads showed a comparable property in human plasma, human liver microsomes and %unbound of protein binding compared to DXd.

[0649] Table 7. Solubility of payloads.

[0650] Example 3: Efflux of payload

[0651] NCI-NCI-H460 cells were plated in a 96-well plate at 2x103 cells per well in a culture medium. On the next day, cells were exposed to DXd and SN38 at various concentrations with or without 10 μM Elacridar for 72 hours. Cell viability was determined using reagent (Promega, Madison, WI) according to the manufacturer's instructions. Viability was normalized to the cells with DMSO only. Fold was calculated as IC50 without Elacridar / IC50 with Elacridar.

[0652] As shown in Table8, C11 show lower efflux than Dxd and SN-38, indicating better activity in cells with high drug resistance.

[0653] Table8. Efflux of payloads.

[0654] Example 4: Rat PK of payloads

[0655] All animal experiments at Shanghai Hansoh BioMedical Co, Ltd. were approved by Shanghai Hansoh’s Institutional Animal Care and Use Committee. Studies were performed in accordance with ARRIVE guidelines. SD rats (160–180 g body weight) were purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. After an adaptation period, rats were randomly divided into two groups (n = 3 for each group) . Payloads dissolved in 5%DMSO+10%Solutol+85%PBS were intravenously administered at a dose of 0.3 mg / kg and 1 mg / kg, respectively. Blood samples were collected at various time points after dosing. Aliquots (20.0 μL each) of all plasma samples were added to a 96-well plate on wet ice. 400 μL of 0.1%FA in ACN containing internal standard was added to each well followed by vortex mixing for 10 min. The supernatant was then separated from the precipitated proteins by positive pressure device and was transferred to a new 96-well plate. The supernatant was evaporated to dryness under a nitrogen stream and redissolved with 20%MeOH. The appropriate amount of samples were injected to LC-MS / MS (Shimadzu LC 40 and AB Sciex 6500 plus) for analysis using MRM mode. DXd (MedChemExpress, 1599440-33-1) was used as a references. As shown in Table 9, smaller AUC and greater CL suggested that C11 has a faster clearance, indicating less toxic as a free payload and thus greater advantages in terms of safety compared to DXd.

[0656] Table 9. PK parameters of payloads DXd and C11 in Rats

[0657] Example 5: In-vitro cytotoxicity of EGFRxHER3 ADCs

[0658] In-vitro cytotoxicity of ADCs was evaluated using the protocol as instructed by the CellTiter-Glo kit (Promega, Cat. No G7573) . NCI-H1975 cells (non-small cell lung cancer cell line, NCI) , HCC827 (ATCC) , A431, BxPC3, Calu-6, NCI-H460, Detroit cells were tested. Briefly, 2x103 cells in 50 μL RPMI medium with 10%FBS were added to each well of white flat bottom 96-well plate (Corning, Costar, Fisher Scientific, Waltham, MA) . Plates were incubated at 37 ℃, 5%CO2 overnight. Next day, the test ADCs in PBS were diluted to a stock 200 nM in RPMI+10%FBS. Treatments were then serially diluted 1: 4 in RPMI+10%FBS+0.2%DMSO. 50 μL of this series was added to each well in triplicate, resulting test compounds in a range from 3 pM to 200 nM. Media-only controls were also included. Plates were incubated for 6 days. At the end of the incubation, 100 μl of substrate solution (Promega, Madison, WI) was added to each well. Luminescence was measured using an EnVision Multilabel pate reader (Perkin Elmer, Waltham, MA) . Data were analyzed and plotted using GraphPad Prism software (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA) . Conjugated ADCs of deruxtecan with EHW1, EHW4 and B7H3 were used as a reference.

[0659] Refer to aforementioned experimental method, EHW1-C13, EHW1-C57, EHW1-C121, EHW1-C122, EHW1-C124 were tested in A431, BxPC3, NCI-H1975 cells, the results as shown in Table 10, Figure 3-6, EHW1-C13 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in A431 (Figure 3A) , BxPC3 (Figure 3B) , NCI-H1975 (Figure 3C) cells; EHW1-C57 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in A431 (Figure 4A) , BxPC3 (Figure 4B) , NCI-H1975 (Figure 4C) cells; EHW1-C121 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in A431 (Figure 5A) , BxPC3 (Figure 5B) , NCI-H1975 (Figure 5C) cells, EHW1-C122 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in A431 (Figure 6A) , BxPC3 (Figure 6B) , NCI-H1975 (Figure 6C) cells, EHW1-C124 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in A431 (Figure 7A) , BxPC3 (Figure 7B) , NCI-H1975 cells (Figure 7C) .

[0660] Table 10. in vitro cytotoxicity of antibody-drug conjugates on tumor cells

[0661] Refer to the aforementioned experimental method, EHW4-C13, EHW4-C57, EHW4-C120, EHW4-C54, EHW4-C53 were tested in NCI-H1975 cells, the results as shown in Table 11 and Figure 8, EHW4-C13, EHW4-C57, EHW4-C120 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in NCI-H1975 cells (Figure 8A) ; EHW4-C13, EHW4-C54, EHW4-C53 showed better in vitro cytotoxicity compared to Deruxtecan conjugated ADC in NCI-H1975 cells (Figure 8B) .

[0662] Table 11. in vitro cytotoxicity of antibody-drug conjugates on tumor cells

[0663] Refer to the aforementioned experimental method, B7H3-C125 was tested in NCI-H460, Detroit cells, the results as shown in Table 12 and Figure 9, B7H3-C125 showed better in vitro cytotoxicity in NCI-H460 (Figure 9A) , Detroit (Figure 9B) cells compared to reference.

[0664] Table 12. in vitro cytotoxicity of antibody-drug conjugates on tumor cells

[0665] Refer to the aforementioned experimental method, B7H3-C118, B7H3-C117, B7H3-C125, B7H3-C126, B7H3-C130 were tested in Calu-6, NCI-H1975, MCF-7 cells, the results as shown in Table 13, B7H3-C118, B7H3-C117, B7H3-C125, B7H3-C126, B7H3-C130 showed better or comparable in vitro cytotoxicity compared to reference.

[0666] Table 13. in vitro cytotoxicity of antibody-drug conjugates on tumor cells Note: “- “represents no relevant experimental data

[0667] EHW1-C117 and EHW1-117-Dxd comprise same linker and antibody part, EHW1-C117 uses C117 as payload which differs from EHW-117-Dxd. The two compounds were tested in NCI-H1975 and BxP3 cells, the result as shown in Table 14 and Figure 15, EHW1-117 showed better in-vitro cytotoxicity in NCI-H1975 (Figure 15A) and BxP3 cells (Figure 15B) compared to EHW1-117-Dxd, indicating the cytotoxicity effect caused by C117.

[0668] Table 14. in vitro cytotoxicity of antibody-drug conjugates on tumor cells Note: The NCI-H1975 cell line experiment here employed the same methodology as Example  5, with the only difference being the cell concentration of "3×103 cells in 50 μL RPMI medium" .

[0669] Example 6: In-vivo tumor inhibition of EGFRxHER3 ADCs

[0670] Six-to eight-week-old female Nu / J mice were purchased from Jackson Laboratory and used in the study. Briefly, 5 million cells were injected subcutaneously into each mouse in 0.2 mL of PBS containing 33%Matrigel. When tumors reached a size of 150–200 mm3, mice were randomized into groups and administered the antibody-drug conjugate (ADC) at varying doses via intraperitoneal (i.p. ) injection. Tumor size and body weight were measured twice weekly. Tumor volume was calculated using the formula:

[0671] V = 0.5 × L × W2

[0672] , where L is the tumor length and W is the width. Mice were euthanized when any tumor dimension reached 2 cm.

[0673] EHW4-C13, EHW4-C57, EHW4-C120, EHW4-C54, EHW4-C53 were tested in NCI-H1975 mouse model, as shown in table 15 and Figure 10, EHW4-C13, EHW4-C57, EHW4-C120 (Figure 10A) , EHW4-C54, EHW4-C53 (Figure 10B) showed stronger inhibition on tumor growth than Deruxtecan conjugated ADCs in NCI-H1975 mouse model.

[0674] Table 15. in-vivo tumor inhibition of EGFRxHER3 ADCs

[0675] Refer to the aforementioned experimental method, EHW4-C53 and EHW4-C13 were tested in MX-1 mouse model, the results as shown in table 16 and Figure 11, EHW4-C53 showed stronger inhibition on tumor growth than Deruxtecan conjugated ADCs in MX-1 mouse model at 1mg / kg and 3mg / kg dose (Figure 11A) ; EHW4-C13 showed stronger inhibition on tumor growth than Deruxtecan conjugated ADCs in MX-1 mouse model at 3mg / kg dose (Figure 11B) .

[0676] Table 16. in-vivo tumor inhibition of EGFRxHER3 ADCs

[0677] Example 7: In-vivo tumor inhibition of B7H3 ADCs

[0678] Six-to eight-week-old female Nu / J mice were purchased from Jackson Laboratory and used in the study. Briefly, 5 million cells were injected subcutaneously into each mouse in 0.2 mL of PBS containing 33%Matrigel. When tumors reached a size of 150–200 mm3, mice were randomized into groups and administered the antibody-drug conjugate (ADC) at varying doses via intraperitoneal (i.p. ) injection. Tumor size and body weight were measured twice weekly. Tumor volume was calculated using the formula:

[0679] V = 0.5 × L × W2,

[0680] where L is the tumor length and W is the width. Mice were euthanized when any tumor dimension reached 2 cm.

[0681] B7H3-C117, B7H3-C118, B7H3-C119, B7H3-C13 were tested in NCI-H1975 mouse model, as the result shown in table 17 and Figure 12, B7H3-C117, B7H3-C118, B7H3-C119, B7H3-C13 showed stronger inhibition on tumor growth than Deruxtecan conjugated ADC in NCI-H1975 mouse model (Figure 12A, Figure 12C) ; B7H3-C117, B7H3-C118, B7H3-C119, B7H3-C13 showed good safety in NCI-H1975 mouse model (Figure 12B) .

[0682] Table 17. in-vivo tumor inhibition of B7H3 ADCs

[0683] Example 8: In-vivo Efficacy of ADCs in Calu-6 Model

[0684] Six-to eight-week-old female Nu / J mice were purchased from Jackson Laboratory and used in the study. Briefly, 5 million cells were injected subcutaneously into each mouse in 0.2 mL of PBS containing 33%Matrigel. When tumors reached a size of 150–200 mm3, mice were randomized into groups and administered the antibody-drug conjugate (ADC) at varying doses via intraperitoneal (i.p. ) injection. Tumor size and body weight were measured twice weekly. Tumor volume was calculated using the formula:

[0685] V = 0.5 × L × W2,

[0686] where L is the tumor length and W is the width. Mice were euthanized when any tumor dimension reached 2 cm.

[0687] B7H3-C117, B7H3-C118, B7H3-C119, B7H3-C13 were tested in Calu-6 mouse model, as the result shown in Table 18 and Figure 13, B7H3-C117, B7H3-C118, B7H3-C119, B7H3-C13 showed stronger inhibition on tumor growth than Deruxtecan conjugated ADCs in Calu-6 mouse model.

[0688] Table 18. in-vivo tumor inhibition of B7H3 ADCs

[0689] Example 9: Serum Stability of New ADCs

[0690] An ADC stock solution was added into human, monkey, or mouse serum to make a final concentration of 0.2 mg / mL or 0.01 mg / mL. The aliquot of ADC plasma mixture is 300 μL each. Samples were incubated at 37 ℃ for 0, 3 and 7 days, then stored at -80 ℃ before purification. For immunocapture, 10 μL serum samples, 20 μL treated magnetic beads (biotinylated with anti-human IgG) and 100 μL PBST were mixed and incubated for 1 h at room temperature under 1250 rpm. Remove supernatant by a magnetic stand and wash beads three times with PBST. Then drugs were eluted using trifluoroacetic acid solution. For total antibody analysis, take 35 μL supernatant, add 70 μL 200 mM ammonium bicarbonate and mix well. Conduct denature at 85 ℃, reduction by dithiothreitol, and alkylation by iodoacetamide. Then the trypsin was used for digestion at 37 ℃ under 1250 rpm, and the reaction was terminated by trifluoroacetic acid. For conjugated payload analysis, take 70 μL supernatant, and add activated cathepsin B solution for payload release. Digestion reaction was performed at 37 ℃ under 1250 rpm and terminated by trifluoroacetic acid. Both signature peptides for total protein analysis and payloads were quantified using LC-MS / MS (Shimadzu LC 40 and AB Sciex 6500 plus) with MRM mode.

[0691] Serum stability of B7H3-C117, B7H3-C118, B7H3-C119, B7H3-C13 were tested, the result as shown in Table 19-20 and Figure 14, on day 7, B7H3-C117, B7H3-C118, B7H3-C119, B7H3-C13 showed better stability in human, monkey and mouse serum compared to Deruxtecan conjugated ADCs.

[0692] Table 19. Serum stability of B7H3 ADCs

[0693] Table 20. Serum stability of B7H3 ADCs

[0694] Example 10: Hydrophobicity

[0695] The hydrophobicity analysis of ADCs was analyzed by hydrophobic interaction chromatography (HIC) with AdvanceBio HIC 4.6x100 mm column (PN#685975-908, Agilent) using Agilent 1260 HPLC system. ADCs about 1 mg / mL was injected to the column (injection volume 15 μl) and separated by gradient run at 0.5 mL / min with mobile phase: Buffer A, 1.5 M Ammonium Sulfate, 50 mM Sodium Phosphate pH=7.0, 5%IPA; Buffer B: 50 mM Sodium Phosphate pH=7.0, 20%IPA. Gradient condition was 0-1 min, 0%B; 1-20 min, 0%B-100%B, 20-25 min, 100B%, 25-30 min, 100%B-0%B; 30-35 min, 0%B.

[0696] Hydrophobicity of EHW1-C13 and EHW1-C53 were tested, the result as shown in Table 21, both C13 and C53 conjugated ADCs were less hydrophobic than Deruxtecan conjugated ADCs, indicating advantages in terms of dissolution stability and pharmacokinetics (PK) .

[0697] Table 21. Hydrophobicity of Abs / ADCs

[0698] Example 11: Mouse PK

[0699] Studies were performed in accordance with ARRIVE guidelines. C57BL / 6 mice (15–18 g body weight) were purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Linker payloads were conjugated to anti-B7H3 atntibody to received ADCs, which were administered intravenously at 5 mg / kg. Blood samples were collected at various time points after dosing. For immunocapture, 10 μL serum samples, 20 μL treated magnetic beads (biotinylated with anti-human IgG) and 100 μL PBST were mixed and incubated for 1 h at room temperature under 1250 rpm. Remove supernatant by a magnetic stand and wash beads three times with PBST. Then drugs were eluted using trifluoroacetic acid solution. For total antibody analysis, take 35 μL supernatant, add 70 μL 200 mM ammonium bicarbonate and mix well. Conduct denature at 85 ℃, reduction by dithiothreitol, and alkylation by iodoacetamide. Then the trypsin was used for digestion at 37 ℃ under 1250 rpm, and the reaction was terminated by trifluoroacetic acid. For conjugated payload analysis, take 70 μL supernatant, and add activated cathepsin B solution for payload release. Digestion reaction was performed at 37 ℃ under 1250 rpm and terminated by trifluoroacetic acid. Both signature peptides for total protein analysis and payloads were quantified using LC-MS / MS (Shimadzu LC 40 and AB Sciex 6500 plus) with MRM mode.

[0700] As shown in Table 22, C117 and C118 conjugated ADCs showed superior stability in mouse PK compared to Deruxtecan conjugated ADC, which offers greater advantages in terms of safety compared to Deruxtecan conjugated ADC.

[0701] Table 22. Mouse PK of B7H3 ADCs

[0702] Example 12. Monkey toxicity study

[0703] A non-GLP dose range-finding (DRF) study was conducted in monkeys to evaluate the toxicity of B7H3-targeting antibody-drug conjugates (ADCs) disclosed in this invention.

[0704] Dosing regimen is as follows: Animals were administered doses every 3 weeks (Q3W) for a total of 4 doses. Dose levels were escalated as: Dose 1 (Day 1) : 15 mg / kg, Dose 2 (Day 22) : 15 mg / kg, Dose 3 (Day 43) : 30 mg / kg, Dose 4 (Day 64) : 45 mg / kg.

[0705] Animals and Grouping: One male and one female per group. Dosing began on July 1, 2025.

[0706] Key Observations (as of Day 49) : ADCs disclosed in this invention show less toxicity compared with positive control, especially for B7H3-C118. No significant changes in body weight, food consumption, clinical observations, or clinical pathology were noted in monkeys. For positive control, Males showed decreased neutrophil count and percentage from Day 7, with nadir around Day 21. Females showed decreased neutrophil count and percentage at Day 49.

[0707] For B7H3-C118, no notable adverse effects under the tested conditions was observed, which offers greater advantages in terms of safety compared to the positive control which induced hematological changes.

[0708] Although specific embodiments of the present disclosure have been described above, it will be appreciated by those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative and that many changes or modifications can be made to these embodiments without departing from the principles and spirit of the present disclosure. The scope of protection of the present disclosure is therefore defined by the appended claims.

Claims

1.A compound of formula (E) : or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof, wherein,R1, R2 are each independently selected from the group consisting of (i) absent, hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, amino-carbonyl, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio,  (ii) cycloalkyl, alkyl-cycloalkyl, heterocyclyl, alkyl-heterocyclyl, aryl, alkyl-aryl, heteroaryl, alkyl-heterocyclyl, R1 and R2 are each independently optionally substituted with 1, 2, 3, 4, or 5 of R1a;or R1 and R2 together with the atoms to which they are attached form a structure selected from the group consisting of cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, the heterocyclyl and heteroaryl are each independently containing heteroatoms selected from N, O or S, the cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl are each optionally substituted with 1, 2, 3, 4, or 5 of R1a;R12 is selected from the group consisting of hydrogen, R3 and R10 are each independently selected from the group consisting of (i) absent, hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio, (ii) cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, R3 is optionally substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R3a, R10 is optionally substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R10a;R4, R11 and R12a are each independently selected from the group consisting of hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, amino, cyano, hydroxyl, halogen;R1a, R3a and R10a are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio, azide, sulfonyl, amino-carbonyl (ii) cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, -alkyl-heterocyclyl, R1a, R3a, R10a and R15a are each independently optionally substitute with 1, 2, 3, 4, or 5 of R7, heterocyclyl and heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q;R5, R6 and R7 are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, hydroxyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkylthio, halogen, haloalkyl, haloalkoxy, halo-alkylthio, azide, -alkyl-azide (ii) cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, -alkyl-cycloalkyl, -alkyl-heterocyclyl, -alkyl-aryl, -alkyl-heteroaryl;m is 0, 1, 2, 3 or 4;q is 0, 1 or 2.2.The compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to claim 1, wherein, the compound has a structure of formula (A) 3.The compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to claim 1 to 2, wherein,  is one structure selected from the group consisting of is selected from the group consisting of 4.The compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 1 to 3, wherein,  is 5.The compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 1 to 4, wherein, R3 and R10 are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, C1-6 halo-alkylthio; (ii) C3-10 cycloalkyl, 5 to 10 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, C6-10 aryl, 5 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, optionally R3 is substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R3a;preferably, R3 and R10 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, C1-3 alkyl, C2-4 alkenyl, C1-3 alkylthio, C1-3 haloalkyl, C13 hydroxyalkyl, C1-3 aminoalkyl, C1-3 cyanoalkyl, C1-3 alkoxy, C1-3 alkoxyalkyl, C1-3 haloalkoxy, and C1-3 halo-alkylthio;more preferably, R3 and R10 are each independently selected from the group consisting of methyl, hydrogen.6.The compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 1 to 5, wherein, R1a, R3a and R10a are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, C1-6 halo-alkylthio, azide, sulfonyl, amino-carbonyl (ii) C3-10 cycloalkyl, 3 to 10 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S, C6-10 aryl, 3 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, optionally R3a is substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R7.7.The compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 1 to 6, wherein, R1a, R3a and R10a are each independently selected from the group consisting of amino-carbonyl, C2-4 alkenyl, sulfonyl, cyano, azide, 4-8 membered heterocyclyl containing 1, 2 or 3 heteroatoms selected from N, O or S, 5 membered heteroaryl containing 1, 2, 3 or 4 heteroatoms selected from N, O or S, optionally R3a is substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R7;preferably, R1a, R3a and R10a are each independently selected from the group consisting of –N3, -CN, optionally R3a is substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 of R7;more preferably, R1a, R3a and R10a are each independently selected form the group consisting of –N3, -CN, 8.The compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 1 to7, wherein, each R7 is independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, C1-6 halo-alkylthio, azide, C1-3 alkyl-azide (ii) C3-10 cycloalkyl, -C1-3 alkyl-5 to 10 membered heterocyclyl, 5 to 10 membered heterocyclyl, the heterocyclyl contains 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, C6-10 aryl, 5 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S;preferably, each R7 is independently selected from the group consisting of C1-3 alkyl, hydroxyl, halogen, C1 alkyl-azide, C1-3 alkylthio, C1-3 haloalkyl, C1-3 hydroxyalkyl, C1-3 aminoalkyl, C1-3 cyanoalkyl, C1-3 alkoxy, C1-3 alkoxyalkyl, C1-3 haloalkoxy, and C1-3 halo-alkylthio, C3-6 cycloalkyl, -methyl-6 membered heterocycle, 3 to 6 membered heterocyclyl, the heterocyclyl contains 1, 2 or 3 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, C6-10 aryl, 6 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S;more preferably, each R7 is independently selected from the group consisting of –F, methyl, -OH,and phenyl.9.The compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 1 to 8, wherein R4, R11 and R12a are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, C1-6 halo-alkylthio, azide, (ii) C3-10 cycloalkyl, 5 to 10 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, C6-10 aryl, 5 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S;preferably, R4, R11 and R12a are each independently selected from the group consisting of hydrogen, amino, C1-3 alkyl, hydroxyl, halogen, C1-3 alkylthio, C1-3 haloalkyl, C1-3 hydroxyalkyl, C1-3 aminoalkyl, C1-3 cyanoalkyl, C1-3 alkoxy, C1-3 alkoxyalkyl, C1-3 haloalkoxy, C3 cycloalkyl, C3-5 alkynyl and C1-3 halo-alkylthio;more preferably, R4, R11 and R12a are each independently selected from the group consisting of hydrogen, -CH3, –OH, -NH2, 10.The compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 1 to 9, wherein, R1 and R2 are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, amino-carbonyl, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, C1-6 halo-alkylthio, azide,  C3-10 cycloalkyl, 5 to 10 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S (O) q, C6-10 aryl, 5 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S;or R1 and R2 together with the atoms to which they are attached form a structure selected from the group consisting of C3-10 cycloalkyl, 5 to 10 membered heterocyclyl, C6-10 aryl and 5 to 10 membered heteroaryl, the heterocyclyl and heteroaryl are each independently containing 1, 2, 3, 4 or 5 heteroatoms selected from N, O or S, the cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl are each independently optionally substituted with 1, 2, 3, 4, or 5 of R1a;preferably, R1 and R2 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, amino-carbonyl, C1-3 alkyl, hydroxyl, halogen, amino, C1-3 alkylthio, C1-3 haloalkyl, C1-3 hydroxyalkyl, C1-3 aminoalkyl, C1-3 cyanoalkyl, C1-3 alkoxy, C1-3 alkoxyalkyl, C1-3 haloalkoxy, and C1-3 halo-alkylthio, or R1 and R2 together with the atoms to which they are attached form a 3-6 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3 or 4 of heteroatoms selected from N, O or S, the 3-6 membered heterocyclyl is optionally substituted with 1, 2, 3 or 4 of R1a;more preferably, R1 and R2 are each independently selected from the group consisting of –H, –CH3, -CD3, -NH2, and –F;or R1 and R2 together with the atoms to which they are attached form a structure of which is optionally substituted with 1 of R1a.11.The compound according to anyone of claims 1 to 10, wherein, R5 and R6 are each independently selected from the group consisting of (i) hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, C1-6 halo-alkylthio, azide, (ii) C3-10 cycloalkyl, 3 to 10 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S, C6-10 aryl, 3 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S;preferably, R5 and R6 are each independently selected from the group consisting of C1-3 alkyl, hydroxyl, halogen, C1-3 alkylthio, C1-3 haloalkyl, C1-3 hydroxyalkyl, C1-3 aminoalkyl, C1-3 cyanoalkyl, C1-3 alkoxy, C1-3 alkoxyalkyl, C1-3 haloalkoxy, and C1-3 halo-alkylthio;more preferably, R5 and R6 are each independently selected from the group consisting of –CH2CH3 and -OH.12.A linker-drug compound or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof, wherein the linker-drug conjugate comprises a formula (F) of: wherein R1 and R2 are as defined in anyone of claims 1, 2 and 10, R5 and R6 are as defined in anyone of claims 1, 2, 4 and 11, R12 is as defined in anyone of claims 1, 2, 3, 5-9, R12a is as defined in anyone of claims 1, 2 and 9;S is a unit connected to ligand or absent,L is a linking unit with one terminus conjugated to R12 group of drug and one terminus conjugated to S or ligand.13.A linker-drug compound or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to claim 12, wherein, the linker-drug compound comprises a formula (G) of: 14.A linker-drug compound or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 12-13, wherein, L is represented by the formula L1-L2-L3-L4, R12 is L1 terminus is conjugated to S or ligand, L4 terminus is conjugated to R12 in drug, preferably, L4 terminus is conjugated to R4 group in R12.15.A linker-drug compound or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 14, wherein L1 is represented by the formula: Y1-W1, Y1-W1-Y2-W2, Y1-W1-Y2-W2-Y3 or W1-Y1-W2-Y2-W3,Y1 and Y2 are each independently selected from the group consisting of absent, C3-10 cycloalkyl, 3 to 12 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4, 5 or 6 of heteroatoms independently selected from N, O or S (O) q, C5-10 aryl, and 3 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms independently selected from N, O or S (O) q, optionally cycloalkyl, heterocyclyl, aryl or heteroaryl is substituted with one or more substituents selected from the group consisting of OXO, hydrogen, deuterium, alkyl, azide, halogen, hydroxyl, alkenyl, alkynyl, cyano, amino, alkylthio, haloalkyl, haloalkoxy, hydroxyalkyl, aminoalkyl, cyanoalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl and -alkyl-heterocyclyl;W1, W2 and W3 are each independently selected from the group consisting of absent, C1-12 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 12 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 6 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the C1-12 alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more R8 selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO, C1-12 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 12 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 6 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the C1-12 alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more OXO, hydrogen, halogen, hydroxyl, cyano, amino, alkyl, chloroalkyl, deuterated alkyl, alkoxy and cycloalkyl;L2 is selected from the group consisting of absent, (OCH2CH2) p, W4, (OCH2CH2) pW4, wherein p is an integer from 1 to 20, W4 is selected from the group consisting of absent, C1-8 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 8 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 4 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the C1-8 alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more substituents selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO and C1-4 alky;L3 is a peptide residue consisting of 2 to 8 amino acid residues or absent, wherein the amino acids are optionally further substitute by one or more substituent (s) selected from the group consisting of C (O) (CH2CH2O) z-alkyl, halogen, hydroxy, cyano, amino, alkyl, chloroalkyl, deuterated alkyl, alkoxy, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, alkyl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-heteroaryl and alkyl-heterocyclyl, wherein z is an integer from 1 to 20;L4 is absent or represented by the formula: NR9-W5 or W5, wherein, R9 is selected from the group consisting of hydrogen, deuterium, alkyl, azide, halogen, hydroxyl, alkenyl, alkynyl, cyano, amino, alkylthio, haloalkyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, cyanoalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl and -alkyl-heterocyclyl; W5 is selected from the group consisting of absent, C1-12 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 12 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 6 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the C1-12 alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more substituents selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO, C1-12 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 12 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 6 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S.16.The linker-drug compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to any one of claims 12-15, wherein S is selected from the group consisting of absent, methylsulfony, Br, F, Cl, I and sulfur;preferably, S is selected from the group consisting of absent, Br, I and Sufur.17.The linker-drug compound according to anyone of claims 15 to16, wherein Y1 and Y2 are each independently selected from the group consisting of absent, C5-6 cycloalkyl, 5 to 6 membered heterocyclyl containing 1, 2 or 3 heteroatoms independently selected from N, O or S, C5-6 ayl, and 5 to 6 membered heteroaryl containing 1, 2 or 3 heteroatoms independently selected from N, O or S, optionally cycloalkyl, heterocyclyl, aryl or heteroaryl is substituted with one or more substituents selected from the group consisting of OXO, hydrogen, deuterium, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, cyano, C1-6 cyanoalkyl, amino, C1-6 aminoalkyl, hydroxyl, C1-6 hydroxyalkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 alkoxyalkyl, C1-6 alkylthio, halogen, C1-6 haloalkyl, C1-6 haloalkoxy, azide, C3-10 cycloalkyl, 3 to 10 membered heterocyclyl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S, C6-10 aryl, 3 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2, 3, 4 or 5 of heteroatoms selected from N, O or S;preferably, Y1 and Y2 are each independently selected from the group consisting of*is connected to S, W1 or W2.18.The linker-drug compound according to anyone of claims 15 to 17, wherein W1, W2 and W3 are each independently selected from the group consisting of absent, C1-6 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 8 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 3 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more R8, each R8 is independently selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO, C1-12 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 12 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 3 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more OXO, hydrogen, halogen, hydroxyl, cyano, amino, C1-3 alkyl, C1-3 chloroalkyl, C1-3 deuterated alkyl, C1-3 alkoxy and C1-6 cycloalkyl;preferably, W1, W2 and W3 are each independently selected from the group consisting of absent, *is connected to S , Y1 or Y2, each R8 is independently selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO, and linear heteroalkyl comprising 8 to 12 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 2 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further independently substituted by one or more substitutions selected from OXO, hydrogen, halogen, hydroxyl, cyano, amino, C1-3 alkyl, C1-3 chloroalkyl, C1-3 deuterated alkyl, C1-3 alkoxy and C1-6 cycloalkyl;more preferably, W1, W2 and W3 are each independently selected from the group consisting of absent, -CH2CH2-, *is connected to S , Y1 or Y2.19.The linker-drug compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 15 to 18, wherein L2 is selected from the group consisting of absent, (OCH2CH2) 2-8, W4, (OCH2CH2) 2-8W4, wherein W4 is selected from the group consisting of absent, C1-4 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 4 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 or 2 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more substituents selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO and C1-2 alky;preferably, L2 is selected from the group consisting of absent, -OCH2CH2-, -OCH2CH2W4-, (OCH2CH2) 2, (OCH2CH2) 2W4, (OCH2CH2) 4, (OCH2CH2) 4W4, (OCH2CH2) 8, (OCH2CH2) 8W4, wherein W4 is selected from the group consisting of absent, C (O) , 20.The linker-drug compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 15 to 19, wherein L3 is a peptide residue consisting of 2 to 6 amino acid residues, the amino acid residues are each independently selected from the group consisting of the residues of phenylalanine (Phe, F) , glycine (Gly, G) , valine (Val, V) , lysine (Lys, K) , citrulline, serine (Ser, S) , glutamic acid (Glu) , aspartic acid (Asp) , alanine (Ala, A) , leucine (Leu, L) , isoleucine (Ile, I) , tryptophane (Trp) , methionine (Met) , proline (Pro, P) , threonine (Thr, T) , cysteine (Cys, C) , tyrosine (Tyr, Y) , asparagine (Asn, N) , glutamine (Gln, Q) , histidine (His, H) , arginine (Arg, R) ;preferably, L3 is a peptide residue consisting of 2 to 5 amino acid residues, the amino acid residues are each independently selected from the group consisting of the residues of Lys (K) , Phe (F) , Ala (A) , Gly (G) , Val (V) , wherein the amino acids are optionally further substitute by one or more substituent (s) selected from the group consisting of C (O) - (CH2CH2O) z-CH3, wherein z is an interger from 4 to 12;more preferably, L3 is selected from the group consisting of GGFG, VA, GFG, KGGFG, KVA, wherein Lys (K) is optionally further substitute by one or more substituent (s) selected from the group consisting of -C (O) - (CH2CH2O) z-CH3, wherein z is an interger from 6 to 10.21.The linker-drug compound or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 15 to 20, wherein R9 is selected from the group consisting of hydrogen, deuterium, C1-3 alkyl, azide, halogen, hydroxyl, C1-3 alkenyl, C1-3 alkynyl, cyano, amino, C1-3 alkylthio, C1-3 haloalkyl, C1-3 hydroxyalkyl, C1-3 aminoalkyl, C1-3 cyanoalkyl, C1-3 alkoxy, C1-3 alkoxyalkyl, C3-8 cycloalkyl, 3 to 8 membered heterocyclyl containing 1, 2 or 3 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, C6-10 aryl, 3 to 10 membered heteroaryl containing 1, 2 or 3 of heteroatoms selected from N, O or S; W5 is selected from the group consisting of absent, C1-3 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 6 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 3 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S, wherein the alkyl and linear heteroalkyl are each independently optionally further substituted by one or more substituents selected from the group consisting of absent, hydrogen, OXO, C1-3 alkyl, and linear heteroalkyl comprising 1 to 6 atom (s) , the linear heteroalkyl comprises 1 to 3 heteroatom (s) selected from the group consisting of N, O and S;preferably, R9 is selected from the group consisting of hydrogen and deuterium, W5 is selected from absent and CH2.22.A linker-drug compound, or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof, wherein the compound is selected from: 23.A ligand-drug conjugate or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof, wherein the ligand-drug conjugate comprises a formula (H) of: wherein R1 and R2 are as defined in anyone of claims 1, 2 and 10, R5 and R6 are as defined in anyone of claims 1, 2, 4 and 11, R12 is as defined in anyone of claims 1, 2, 3, 5-9, R12a is as defined in anyone of claims 1, 2 and 9;S is a spacer unit connected to ligand or absent,L is a linking unit with one terminus conjugated to R12 group of drug and one terminus conjugated to S or ligand,n is 1 to 10, which can be an integer or a decimal, preferably 2 to 10 such as 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0; more preferably, n is 6-10, such as 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, even more preferably, n is 7-9, such as 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0; most preferably, n is 7-8, such as 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0.24.A ligand-drug conjugate or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to claim 23, wherein, the the ligand-drug conjugate comprises a formula of: wherein S is as defined i n anyone of claims 12, 13 and 16, L is represented by the formula L1-L2-L3-L4, L1 is as defined in anyone of claims 14, 15, 17and 18, L2 is as defined in anyone of claims 14, 15, and 19, L3 is as defined in anyone of claims 14, 15 and 20, L4 is as defined in anyone of claims 14, 15 and 21, wherein n is 1 to 10, which can be an integer or a decimal, preferably 2 to 10 such as 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0; more preferably, n is 6-10, such as 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, even more preferably, n is 7-9, such as 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0; most preferably, n is 7-8, such as 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0.25.The ligand-drug conjugate or the tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or the pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 23 and 24, wherein the ligand is an antibody or an antigen-binding fragment thereof; preferably, the antibody is selected from the group consisting of chimeric antibody, humanized antibody and fully humanized antibody.26.The ligand-drug conjugate according to claim 25, wherein the antibody or the antigen-binding fragment is targeting one or more targets selected from the group consisting of B7H3, B7H4, CD30, CD5, CD33, CD19, CD37, CD20, CD45, CD56, CD70, CD79b, CD117 / c-Kit, CD137 / 4-1BB, BCMA, CEA, EpCam, Nectin 4, MUC5AC, DLL3, CXCR2, gpNMB, FOLR1, ENPP3, CLDN23, GUCY2C, IL-4, IL-23, CTLA-4, EGFR, CLDN-6, Trop-2, CLDN 18.2, HER3, TIGIT, CDH17, PSMA, MSLN, HER2, c-MET, LILRB4, CD47, PD-1, PD-L1, OX40, IL-17A, TNF-α, RANKL, TSLP, CD38, STEAP1, CDH6, GPRC5D, ROR1, Mesothelin and IL23.27.A ligand-drug conjugate, or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof, wherein the ligand-drug conjugate is: n is 1 to 10, which can be an integer or a decimal, preferably 2 to 10 s uch as 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0; more preferably, n is 6-10, such as 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, even more preferably, n is 7-9, such as 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0; most preferably, n is 7-8, such as 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0.28.A compound, or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof, wherein the compound is: 29.A pharmaceutical composition, comprising a therapeutically effective amount of the ligand-drug conjugate or a tautomer, cis-or trans-isomer, mesomer, racemate, enantiomer, diastereomer, or mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof according to anyone of claims 23-27, and pharmaceutically acceptable carrier (s) , diluent (s) or excipient (s) .30.A method for treating tumor and / or cancer comprising administering the ligand-drug conjugate according to anyone of claims 23 to 27, or the compound according to claims 1 to 11 or a salt thereof to the patient in need.31.The method for treating tumor and / or cancer according to claim 30, wherein the tumor and / or cancer is selected from the group consisting of breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, uterine cancer, prostate cancer, kidney cancer, urethral cancer, bladder cancer, liver cancer, stomach cancer, endometrial cancer, salivary gland cancer, esophageal cancer, melanoma, glioma, neuroblastoma, sarcoma, lung cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, leukemia, bone cancer, skin cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer and lymphoma.

Images