A method of generating a functional MCH neurons

Abstract

The present invention relates to a method of generating a functional MCH neuron, comprising suppressing an expression or activity of vesicular glutamate transporter 2 (vGlut2) in an MCH neuron.

Description

A method of generating a functional MCH neurons

[0001] Introduction

[0002] Melanin-concentrating hormone (MCH) is a cyclic 19-amino-acid peptide, and MCH-producing neurons (MCH neurons) are specialized cells located primarily in the lateral hypothalamic area (LHA) and surrounding areas of the brain such as the zona incerta (ZI) . With extensive projections throughout various brain areas, MCH neurons are part of the neural network that regulates many physiological processes, including energy homeostasis, sleep regulation and wakefulness, reward and reinforcement feeding, memory, and learning.

[0003] There has been growing interest in elucidating the roles of MCH neurons and their neurotransmitters, including neuropeptides, in learning and memory. We reported that after MCH neuronal ablation, mice showed improved hippocampus-dependent memory. In addition, using optogenetics and chemogenetics, the activation of MCH neurons resulted in impaired memory, and their inhibition improved it1. MCH neurons can be classified into three subpopulations based on their sleep and wakefulness-dependent activity, revealing that rapid eye movement (REM) -sleep-active MCH neurons are exclusively related to memory regulation. However, from the molecular perspective of MCH neurons, the role of the MCH in memory has been inconsistent across studies. On the one hand, MCH itself may enhance memory. Infusing MCH into the hippocampus and amygdala increased the time latency or reversed the amnesic effect induced by a nitric oxide synthase inhibitor in a one-trial step-down inhibitory avoidance test in rats, and MCH administration into the nasal cavity restored memory in mouse models of memory impairment and Alzheimer’s disease. On the other hand, Ruiz et al. (2023) showed that acute intrahippocampal administration of MCH impaired memory consolidation in mice in a novel object recognition (NOR) test. Studies have also investigated MCH signaling by intervening in its receptors. In rodents, MCH receptor 1 (MCHR1) functions as the only MCH receptor, and MCHR1-knockout (MCHR1-KO) mice showed memory impairment in an inhibitory avoidance test, supporting the hypothesis that MCH improve memory.

[0004] The role of MCH in regulating energy homeostasis has been emphasized in previous articles, which have reported that MCH neuronal activity promotes energy conservation and the accumulation of food intake. Overexpression of MCH in transgenic mice leads to obesity and insulin resistance. After MCH neuronal ablation, mice exhibit increased caloric expenditure and reduced fat weight. In addition, while acute or chronic MCH intracerebroventricular administration causes hyperphagia and reduces energy expenditure, knocking out either MCH or MCHR1 increases energy expenditure in mouse models.

[0005] Previous studies have focused mainly on the scope of MCH peptide transmission and MCH neurons in the functions mentioned above. However, the other molecular mechanisms by which MCH neurons regulate memory and energy metabolism are poorly understood. Other neuropeptides, including cocaine-and amphetamine-regulated transcript (CART) , nesfatin 1, and vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) , are also expressed in and released from MCH neurons. Additionally, nearly all MCH neurons express vesicular glutamate transporter 2 (vGlut2) , a marker of glutamatergic neurons, but most MCH neurons do not express the vesicular γ-aminobutyric acid (GABA) transporter, a marker of GABA neurons. This pattern of expression suggests that MCH neurons are glutamatergic despite contrary evidence. Photoactivation of channelrhodopsin-2-expressing MCH neurons inhibits the activity of their densely projected areas, such as the lateral septum, by evoking monosynaptic glutamate release, which subsequently induces the secondary release of GABA in local microcircuits. Using the same method to activate MCH neurons decreases hippocampal pyramidal neuronal activity and impairs hippocampus-dependent memory. Glutamatergic signaling from MCH neurons is reported to play a role in anxiety-like behaviors, diurnal variability in REM sleep, and metabolic rate, although the evidence to date remains controversial.Summary of the Invention

[0006] In the present invention, the inventors found that glutamate is an essential neurotransmitter involved in memory regulation by MCH neurons but has a negligible role in controlling metabolism. Specifically, it is found in the present invention that vGlut2 conditional knockout (cKO) in MCH neurons consistently improved the discrimination ratio of the mice in several memory recognition tests but did not significantly affect their metabolic rate.

[0007] The present invention focuses on the role of glutamate from MCH neurons in regulating memory and metabolic rate. Interestingly, glutamatergic signaling loss from MCH neurons enhances general memories in mice, including novel object, location, and social recognition memories, but does not affect their energy metabolism.

[0008] In the first aspect, provided herein is a method of generating a functional MCH neuron, comprising suppressing an expression or activity of glutamate transporter 2 (vGlut2) in an MCH neuron.

[0009] In some embodiments, the method comprises administration of one or more agents that decrease the activity of vGlut2 in MCH neurons, or the expression of vGlut2 in an MCH neuron.

[0010] In some embodiments, the suppressing an expression or activity of vGlut2 in MCH neuron comprises conditional knocking out (cKO) a gene of vGlut2 or a fragment thereof in an MCH neuron.

[0011] In some embodiments, the suppressing an expression or activity of vGlut2 in an MCH neuron comprises conditional knocking out (cKO) a gene of vGlut2 in an MCH neuron using homologous recombination, RNA interference (RNAi) , or DNA or RNA guided nucleases.

[0012] In some embodiments, the homologous recombination is carried out using a DNA recombinase.

[0013] In some embodiments, the method comprises: (A) introducing a first recombinase recognition sequence into an MCH neuron; (B) introducing, after the Step (A) , a second recombinase recognition sequence into the MCH neuron; and (C) obtaining a transformed subject having the first and second recombinase recognition sequences introduced into the MCH neuron.

[0014] In some embodiments, the first and second recombinase recognition sequences are base sequences between which recombination occurs by a DNA recombinase.

[0015] In some embodiments, the DNA recombinase is a serine recombinase.

[0016] In some embodiments, the DNA recombinase is selected from: Bxb1, phiC31, Cre, VCre, SCre, Dre, Flp, KD, B2, B3, R, or gix.

[0017] In some embodiments, the DNA recombinase is Cre, VCre, SCre, Dre, FLP, R, or Gin.

[0018] In some embodiments, the recognition sequence is loxP, VloxP, SloxP, rox, FRT, RS, or gix.

[0019] In some embodiments, the subject conditionally expresses the recombinase.

[0020] In some embodiments, the subject tissue-specifically or period-specifically expresses the recombinase.

[0021] In some embodiments, the subject is a non-human mammal.

[0022] In some embodiments, the subject is a mouse or a rat.

[0023] In some embodiments, the subject is a human-being.

[0024] In some embodiments, the method further comprises: crossing the transformed mouse or rat with a mouse or rat that conditionally expresses a recombinase, to obtain a conditional modified mouse or rat.

[0025] In some embodiments, the conditional knocking out (cKO) the gene in MCH neuron using DNA recombinase is performed at the prenatal stage.

[0026] In some embodiments, exon 2 and / or exon 3 of the gene is excised between the two loxP sites.

[0027] In some embodiments, the DNA recombinase and / or the recombinase recognition sequence are encoded by an expression vector.

[0028] In some embodiments, the expression vector is a virus vector.

[0029] In some embodiments, the virus vector is an adenovirus vector, or an adeno-associated virus vector (AAV) .

[0030] In some embodiments, the AAV is AAV1, AAV2, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV. rh39, AAVrh. 43, AAVrh. 8, or AAVrh. 10.

[0031] In some embodiments, the AAV is AAV2 / 1, AAV2 / 2, AAV2 / 5, or AAV2 / 9.

[0032] In some embodiments, the AAV is AAV9.

[0033] In some embodiments, the RNA interference (RNAi) is carried out using small RNA molecules to silence or degrade the messenger RNA (mRNA) of vGlut2.

[0034] In some embodiments, the nuclease is a Transcription Activator-like Effector Nuclease (TALEN) , Zinc Finger Nuclease (ZFN) , or a CRISPR / Cas-associated protein.

[0035] In some embodiments, the CRISPR / Cas-associated protein is Cas9, Cas6, dCas9, or Cpf1.

[0036] In some embodiments, the suppressing an expression or activity of vesicular glutamate transporter 2 (vGlut2) in MCH neuron comprises expressing in MCH neuron a CRISPR / Cas-associated protein and a guide RNA (gRNA) targeting the gene.

[0037] In some embodiments, the guide RNA is a single guide RNA (sgRNA) targeting a sequence in exons of the gene.

[0038] In some embodiments, the sgRNA targets exon 2 or exon 3 of the gene.

[0039] In some embodiments, the sgRNA targets 5’ -CAGGTTACAGCGGATGCCGAAGG-3’ (SEQ ID NO: 9) (in exon 2) or 5’ -CGATCCGTGGATCATCCCCACGG-3’ (SEQ ID NO: 10) (in exon 3) of the gene.

[0040] In some embodiments, the CRISPR / Cas-associated protein and / or the gRNA are encoded by an expression vector.

[0041] In some embodiments, the expression vector is a virus vector.

[0042] In some embodiments, the virus vector is an adenovirus vector, or an adeno-associated virus vector (AAV) .

[0043] In some embodiments, the AAV is AAV1, AAV2, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV. rh39, AAVrh. 43, AAVrh. 8, or AAVrh. 10.

[0044] In some embodiments, the AAV is AAV2 / 1, AAV2 / 2, AAV2 / 5, or AAV2 / 9.

[0045] In some embodiments, the AAV is AAV9.

[0046] In some embodiments, the agent, or the expression vector is administrated into lateral hypothalamus area (LHA) and surrounding areas of the brain such as the zona incerta (ZI) .

[0047] In the second aspect, provided herein is a recombinant nucleic acid construct, encoding one or more of the following:

[0048] (a) recombinase recognition sequence, and / or DNA recombinase; or (b) CRISPR / Cas-associated protein and / or a guide RNA (gRNA) targeting a gene of vGlut2.

[0049] In some embodiments, the recombinase recognition sequence comprises a first recombinase recognition sequence and a second recombinase recognition sequence, and the first and second recombinase recognition sequences are base sequences between which recombination occurs by a DNA recombinase.

[0050] In some embodiments, the DNA recombinase is a serine recombinase.

[0051] In some embodiments, the DNA recombinase is selected from: Bxb1, phiC31, Cre, VCre, SCre, Dre, Flp, KD, B2, B3, R, or gix.

[0052] In some embodiments, the DNA recombinase is Cre, VCre, SCre, Dre, FLP, R, or Gin.

[0053] In some embodiments, the recognition sequence is loxP, VloxP, SloxP, rox, FRT, RS, or gix.

[0054] In some embodiments, one or more exons of the gene are excised between the two loxP sites using recombinase recognition sequence, and / or DNA recombinase.

[0055] In some embodiments, the DNA recombinase and / or recombinase recognition sequence are encoded by an expression vector.

[0056] In some embodiments, the expression vector is a virus vector.

[0057] In some embodiments, the virus vector is an adenovirus vector, or an adeno-associated virus vector (AAV) .

[0058] In some embodiments, the AAV is AAV1, AAV2, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV. rh39, AAVrh. 43, AAVrh. 8, or AAVrh. 10.

[0059] In some embodiments, the AAV is AAV2 / 1, AAV2 / 2, AAV2 / 5, or AAV2 / 9.

[0060] In some embodiments, the AAV is AAV9.

[0061] In some embodiments, exon 2 and / or exon 3 of the gene is excised between the two loxP sites using recombinase recognition sequence, and / or DNA recombinase.

[0062] In some embodiments, the CRISPR / Cas-associated protein is Cas9, Cas6, dCas9, or Cpf1.

[0063] In some embodiments, the guide RNA is a single guide RNA (sgRNA) targeting a sequence in exons of the gene.

[0064] In some embodiments, the sgRNA targets exon 2 or exon 3 of the gene.

[0065] In some embodiments, the sgRNA targets 5’ -CAGGTTACAGCGGATGCCGAAGG-3’ (SEQ ID NO: 9) (in exon 2) or 5’ -CGATCCGTGGATCATCCCCACGG-3’ (SEQ ID NO: 10) (in exon 3) of the gene.

[0066] In some embodiments, the CRISPR / Cas-associated protein and / or the gRNA are encoded by an expression vector.

[0067] In some embodiments, the recombinant nucleic acid construct is administrated into lateral hypothalamus area (LHA) and surrounding areas of the brain such as the zona incerta.

[0068] In some embodiments, the recombinant nucleic acid construct is formulated for injection, inhalation, parenteral administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intradermal administration, topical administration, or oral administration.

[0069] In the third aspect, provided herein is a vector comprising the recombinant nucleic acid construct of the second aspect.

[0070] In some embodiments, the vector is a virus vector.

[0071] In some embodiments, the virus vector is an adenovirus vector, or an adeno-associated virus vector (AAV) .

[0072] In some embodiments, the AAV is AAV1, AAV2, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV. rh39, AAVrh. 43, AAVrh. 8, or AAVrh. 10.

[0073] In some embodiments, the AAV is AAV2 / 1, AAV2 / 2, AAV2 / 5, or AAV2 / 9.

[0074] In some embodiments, the AAV is AAV9.

[0075] In some embodiments, the vector is administrated into lateral hypothalamus area (LHA) and surrounding areas of the brain such as the zona incerta.

[0076] In some embodiments, the vector is formulated for injection, inhalation, parenteral administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intradermal administration, topical administration, or oral administration.

[0077] In the fourth aspect, provided herein is a recombinant cell comprising the recombinant nucleic acid construct of the second aspect, or the vector of the third aspect.

[0078] In the fifth aspect, provided herein is a pharmaceutical composition comprising the recombinant nucleic acid construct of the second aspect, or the vector of the third aspect, or the recombinant cell of the fourth aspect.

[0079] In some embodiments, the pharmaceutical composition is administrated into lateral hypothalamus area (LHA) and surrounding areas of a brain such as a zona incerta.

[0080] In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated for injection, inhalation, parenteral administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intradermal administration, topical administration, or oral administration.

[0081] In the sixth aspect, provided herein is a method for preventing, treating, ameliorating or delaying an onset of at least one of a neurodegenerative disease, cognitive decline and any conditions or symptoms associated therewith in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the recombinant nucleic acid construct of the second aspect, the vector of the third aspect, the recombinant cell of the fourth aspect, or the pharmaceutical composition of the fifth aspect.

[0082] In some embodiments, the neurodegenerative disease is selected from anxiety, short term memory impairment, long term memory impairment, impaired cognitive function, impaired learning function, oxidative stress or any combination thereof.

[0083] In some embodiments, the neurodegenerative disease is selected from Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Dementia, cognitive decline, Mild Cognitive Impairment (MCI) , Parkinson's disease with MCI, Huntington's disease, Lewy body disease, Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , Prion disease, Motor neuron disease (MND) , Spinocerebellar ataxia (SCA) , Spinal muscular atrophy (SMA) , Friedreich's Ataxia, multiple sclerosis, Idiopathic Intracranial Hypertension, Cranial neuropathies, Trigeminal neuralgia, frontotemporal dementias (FTD) , Senile Dementia (Dementia NOS) , Motor Neuron Disease, bipolar disorder, or any combination thereof.

[0084] In some embodiments, the neurodegenerative disease is Alzheimer's disease.

[0085] In some embodiments, the neurodegenerative disease is memory loss.

[0086] In some embodiments, the subject is a non-human mammal.

[0087] In some embodiments, the subject is a mouse or a rat.

[0088] In some embodiments, the subject is a human-being.

[0089] In some embodiments, the recombinant nucleic acid construct, the vector, the recombinant cell, or the pharmaceutical composition is administrated into lateral hypothalamus area (LHA) and surrounding areas of the brain such as the zona incerta.

[0090] In some embodiments, the recombinant nucleic acid construct, the vector, the recombinant cell, or the pharmaceutical composition is formulated for injection, inhalation, parenteral administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intradermal administration, topical administration, or oral administration.

[0091] In the seventh aspect, provided herein is a use of the recombinant nucleic acid construct of the second aspect, the vector of the third aspect, the recombinant cell of the fourth aspect, or the pharmaceutical composition of the fifth aspect, in the preparation of a medicament for preventing, treating, ameliorating, or delaying an onset of at least one of a neurodegenerative disease, cognitive decline or any conditions or symptoms associated therewith.

[0092] The invention encompasses all combination of the particular embodiments recited herein.Brief Description of the DrawingsFigure 1 shows generation and validation of vGlut2 cKO in MCH neuron in mice.Figure 2 shows higher discrimination ratio in Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox than in Pmch-Cre; Slc17a6+ / + mice in the NOR test.Figure 3 shows workflow for vGlut2 cKO in MCH neurons specifically using the CRISPR / Cas9 system.Figure 4 shows enhancement of the discrimination ratio in the NOR and OL tests after vGlut2 cKO in MCH neurons by CRISPR / Cas9.Figure 5 shows enhancement of the discrimination ratio in the three-chamber test after vGlut2 cKO in MCH neurons by CRISPR / Cas9.Figure 6 shows no significant effect of vGlut2 cKO in MCH neurons on body weight, food intake, oxygen consumption, RQ, or locomotor activity.Figure 7 shows confirmation of vGlut2 cKO in MCH neurons.Figure 8 shows exploration time in each phase of the NOR test with different retention periods (A–C) and OL test (D) between MCH-LacZ and MCH-vGlut2 cKO mouse groups.Figure 9 shows arena and object positions in the NOR (A) , OL (B) , and three-chamber (C) tests.Figure 10 shows schedule for metabolic recording (A) , and illustration of the indirect calorimetry system (B) .

[0093] Description of Particular Embodiments of the Invention

[0094] MCH neurons play essential roles in regulating various functions by extensively projecting to different brain regions via several neurotransmitters, including the neuropeptides MCH, nesfatin-1, CART, and VEGF-A, or the classic neurotransmitter glutamate. The understanding of neurotransmitter signaling pathways other than MCH has remained vague, making it insufficient for understanding the role of MCH neurons. In this study, using cKO of Slc17a6 gene mice, it is investigated the role of glutamate from MCH neurons in regulating memory and metabolic rate. There are three vesicular glutamate transporters, VGLUT1–3, encoded by solute carrier genes Slc17a6-8. VGLUT1 (Slc17a7) and VGLUT2 (Slc17a6) are expressed in glutamatergic neurons, while VGLUT3 (Slc17a8) is expressed in neurons classically defined by their use of another transmitter, such as acetylcholine and serotonin. Interestingly, glutamatergic signaling loss from MCH neurons enhanced general memories in mice, including novel object, location, and social recognition memories but did not affect their energy metabolism.

[0095] MCH neurons are found primarily in the LHA and innervate various brain regions, such as the nucleus accumbens, ventral tegmental area, cortex, amygdala, hippocampus, thalamus, hypothalamus, and brainstem. From directly infusing MCH into the brain or MCHR1 KO, MCH is considered necessary to preserve memory through various mechanisms, including decreasing hippocampal long-term potential thresholds. Nevertheless, we previously reported that MCH neuronal ablation or inhibition of these neurons by manipulation techniques (optogenetics and chemogenetics) improves memory1. These results raised our concern about other spontaneous mechanisms by which MCH neurons prevent memory formation. These neurons release not only MCH but also glutamate and act as glutamatergic neurons. vGlut proteins (vGlut1, vGlut2, and vGlut3) package glutamate into vesicles at presynaptic areas. However, the majority of MCH neurons express vGlut2 exclusively, while a tiny proportion express vGlut3 but not vGlut1.

[0096] In the present invention, it is verified that vGlut2 KO entirely abolishes glutamatergic signaling from these neurons. Conventional approach may be used to disable vGlut2 in MCH neurons, for example, Cre-loxP-dependent KO. Using this approach, mice with vGlut2 cKO in MCH neurons exhibited improved short-term memory in the NOR test. However, by crossing Pmch-Cre mice with Slc17a6flox / flox mice, glutamatergic signaling was inhibited prenatally. To confirm whether there was any biological compensation for the lack of this signaling during the development, which could have caused the memory improvement rather than a lack of vGlut2 itself. The CRISPR / Cas9 system is used to knock out Slc17a6 in MCH neurons in mature mice. Interestingly, this method showed the same phenomenon: inhibiting glutamate released from MCH neurons also increased short-term memory in the NOR test. Moreover, the long-term novel object memory and location-related memory were also strengthened. This enhancement was not restricted to object-related memory alone but was also observed in social recognition memory, as shown in the three-chamber test. These results suggest that (i) in addition to MCH, MCH neurons also use glutamate to regulate memory, and (ii) other modulators cannot compensate for the loss of glutamatergic signaling. MCH neurons are critical for sleep and wakefulness, especially for promoting and sustaining REM sleep. In addition, the MCH neuronal subpopulation activated during REM sleep is involved in forgetting hippocampal memories1. Inhibiting glutamatergic signaling from MCH neurons decreases REM sleep for a short time in the dark period without affecting sleep structure, non-REM sleep, or wakefulness. MCH neurons lacking glutamate can still promote REM sleep. These findings suggest that general memory improvement in mice with selective vGlut2 KO in MCH neurons was not due to the non-REM or REM sleep time alterations.

[0097] Several investigators have reported contrary findings regarding the effect of MCH neuronal glutamate on energy homeostasis. Schneeberger et al. (2018) reported that compared with Slc17a6flox / flox mice, Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice [using the Tg (Pmch-cre) 1Rck / J19 strain] had a lower body weight, hyperactivity, late-onset hypophagia, lower leptin level, improved glucose tolerance, and loss of sucrose preference2. Meanwhile, another study, using the same mouse model comparison Slc17a6flox / flox vs. Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox but a different Pmch-Cre mouse strain [Tg (Pmch-cre) 1Lowl / J] , found no effect of vGlut2 KO in MCH neurons on body weight, blood glucose levels, feeding, oxygen consumption, locomotor activity, or body temperature3. In the two studies mentioned above, using Slc17a6flox / flox mice as a control group to compare with Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice may have some limitations due to the potential effect on the metabolism of Cre expression or Pmch-cre gene insertion into anonymous chromosomes. To resolve this, it was compared that Pmch-Cre; Slc17a6+ / +, Pmch-Cre; Slc17a6flox / +, and Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice using Pmch-Cre mice with [Tg (Pmch-cre) 1Lowl / J] background. The body weight of Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice was lower than that of Pmch-Cre; Slc17a6+ / + mice only when the mice were 4 and 5 weeks of age. This lower body weight could be explained by the fact that mouse pups were mainly nurtured by maternal milk before they were 4 weeks old (weaning time point) . During this period, the size of pups, or physical development in general, is significantly affected by feeding conditions such as parental mental and physical health, care, or the quantity of pup littermates. After weaning and isolation, Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice started to reach the average weight of the two other groups from 6 weeks of age and maintained this condition until they were at least 15 weeks old, as demonstrated in the present study. Our findings support no significant effect of glutamate in MCH neurons on body weight in general, caloric intake, or energy expenditure. Therefore, our results are consistent with those of Sankhe et al. 3, but not mouse line with those of Schneeberger et al. 2. These inconsistent results may stem from the use of different Pmch-Cre mouse strains between the studies, as discussed previously3. It was concerned with the ectopic expression of Cre outside MCH neurons in the Tg (Pmch-cre) 1Rck / J19 mouse strain and the subsequent off-target effect of vGlut2 KO on metabolism. Moreover, MCH neuronal ablation, MCH KO, and MCHR1 KO have been consistently reported to increase energy expenditure and reduce fat weight, and an MCHR1 antagonist caused hypophagia in an MCHR1-KO model7. It seems that the MCH peptide, rather than glutamate, might play an important role in the metabolic regulation of MCH neurons.

[0098] The present invention confirmed that glutamate is an essential neurotransmitter used by MCH neurons to regulate memory but not to control metabolism. Using the three-chamber test has some limitations in assessing social memory because the complexity of this memory type cannot be entirely expressed through sociability and social novelty ability after short-term familiarization. The present invention suggests that direct glutamatergic signaling from MCH neurons the hypothalamus to the hippocampus is mainly responsible for memory regulation.

[0099] Melanin-concentrating hormone (MCH) is a cyclic 19-amino-acid peptide, and MCH-producing neurons (MCH neurons) are specialized cells located primarily in the lateral hypothalamus area (LHA) and surrounding areas of the brain such as the zona incerta. With extensive projections throughout various brain areas, MCH neurons are part of the neural network that regulates many physiological processes, including energy homeostasis, sleep and wakefulness, reward and reinforcement feeding8, memory, and learning.

[0100] Melanin-concentrating hormone-producing neurons (MCH neurons) , found mainly in the lateral hypothalamus and surrounding areas, play essential role in various brain functions, including sleep and wakefulness, reward, metabolism, learning, and memory.

[0101] MCH neurons regulate various vital physiological processes. In addition to the MCH peptide, these neurons co-express several other neurotransmitters, which are involved in complex molecular control of their functions.

[0102] The Cre / lox system uses the Cre recombinase, which catalyzes site-specific recombination by crossover between two distant Cre recognition sequences, i.e., loxP sites. A DNA sequence introduced between the two loxP sequences (termed floxed DNA) is excised by Cre-mediated recombination. Control of Cre expression in a transgenic animal, using either spatial control (with a tissue-or cell-specific promoter) or temporal control (with an inducible system) , results in control of DNA excision between the two loxP sites. One application is for conditional gene inactivation (conditional knockout) . Another approach is for protein over-expression, wherein a floxed stop codon is inserted between the promoter sequence and the DNA of interest. Genetically modified animals do not express the transgene until Cre is expressed, leading to excision of the floxed stop codon. This system has been applied to tissue-specific oncogenesis and controlled antigene receptor expression in B lymphocytes. Inducible Cre recombinases have also been developed. The inducible Cre recombinase is activated only by administration of an exogenous ligand. The inducible Cre recombinases are fusion proteins containing the original Cre recombinase and a specific ligand-binding domain. The functional activity of the Cre recombinase is dependent on an external ligand that is able to bind to this specific domain in the fusion protein.

[0103] The descriptions of particular embodiments and examples are provided by way of illustration and not by way of limitation. Those skilled in the art will readily recognize a variety of noncritical parameters that could be changed or modified to yield essentially similar results.Examples

[0104] Materials and methods

[0105] Ethical approval

[0106] The Institutional Animal Care and Use Committees of Research Institute of Environmental Medicine, Nagoya University, and CIBR approved all experimental procedures involving animals (approval nos. R210096 and R210729 for Nagoya University and CIBR-IACUC-058 for CIBR) . All efforts were made to minimize animal use and any discomfort or pain.

[0107] Animals

[0108] Mice were housed in dedicated animal facility cages, allowed access to food and water ad libitum, and maintained in a controlled environment at an average temperature of 22–23.5℃, under a 12 / 12-h light / dark cycle (light on at Zeitgeber time [ZT] 0 [light] and light off at ZT 12 [dark] ) . All experiments were conducted using male mice.

[0109] The mouse lines used were Pmch-Cre (Tg (Pmch-cre) 1Lowl / J #014099, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) , Slc17a6flox (Slc17a6tm1Lowl / J, #012898, Jackson Laboratory) , which possess loxP sites flanking exon 2 of Slc17a6, Ai14 (Rosa26LSL-tdTomato; B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J, #007914; Jackson Laboratory) and Rosa26LSL-Cas9 (B6J. 129 (B6N) -Gt(ROSA) 26Sortm1 (CAG-cas9*, -EGFP) Fezh / J, #026175, Jackson Laboratory) , which possess a STOP-flox cassette preventing expression of the downstream bicistronic sequences (Cas9 and EGFP) . All strains were maintained on a C57BL / 6J genetic background. Wild-type C57BL / 6J mice were obtained from CLEA Japan (Tokyo, Japan) .

[0110] To generate three genotypes of Slc17a6flox (wild type, heterozygous, and homozygous) in Pmch-Cre mice, we initially crossed Pmch-CreTg / Tg with Slc17a6flox / flox mice. The F1 offspring (Pmch-CreTg / 0; Slc17a6flox / +) were crossed back with Pmch-CreTg / Tg mice, and only the F2 offspring (Pmch-CreTg / Tg; Slc17a6flox / +) were used for self-mating to generate the following three bigenic strains: Pmch-CreTg / Tg; Slc17a6+ / +, Pmch-CreTg / Tg; Slc17a6flox / +, and Pmch-CreTg / Tg; Slc17a6flox / flox (hereafter referred to as Pmch-Cre; Slc17a6+ / +, Pmch-Cre; Slc17a6flox / +, and Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox, respectively) . The Pmch-Cre; Rosa26LSL-tdTomato; Slc17a6+ / + and Pmch-Cre; Rosa26LSL-Cas9 mouse lines were generated by mating Pmch-CreTg / Tg mice with Rosa26LSL-tdTomato and Rosa26LSL-Cas9 mice, respectively.

[0111] Genotyping and DNA sequencing

[0112] Mouse brain tissues were fixed in 10%formalin (066-03847, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) , and DNA was extracted using the REDExtract-N-AmpTMTissue PCR Kit (XNAT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) , according to the manufacturer’s instructions with minor modifications. In brief, for each sample (2 mm mousetail tip or 4 to 5 brain slices from a specific area) , we prepared a premixed solution of 24 μL extraction solution and 6 μL tissue preparation solution (4: 1 ratio) . The sample was added to the mixture, vortexed, and incubated at room temperature for 10 min and then at 95℃ for 3 min. Then, 25 μL neutralization solution was added, and the sample was stored at 4℃ for up to 6 months until use. After extraction, crude genomic DNA was amplified using the KOD FX Neo procedure (KFX-201, Toyobo, Kita, Osaka, Japan) . We prepared 10 μL reactions containing Milli-Q water (1.6 μL) , 2× PCR buffer for KOD FX Neo (5 μL) , 2 mM dNTPs (2 μL) , 10 pmol / μL primers #1 (0.1 μL) and #2 (0.1 μL) , template DNA (1 μL) , and 1.0 U / μL KOD FX Neo (0.2 μL) . Based on the Slc17a6 sequence (accession no. NC_000073.7) and the original procedure for generating the Slc17a6flox mouse line4, the following primer pairs were used (Primer3, web version 4.1.0; https:  / / primer3. ut. ee / ) : primer pair 1 (5′-CCTGAGCGAAGGTGAGCTGAA-3′ (SEQ ID NO: 1) and 5′-CCAAATACCTGAAAGTTACTG-3′ (SEQ ID NO: 2) ) , the outer primer pair (5′-TGGTGTTAAAATTCCATAGGC-3′ (SEQ ID NO: 3) and 5′-GGTGCACAGTTGAAGGTTC-3′ (SEQ ID NO: 4) ) , and the inner primer pair (5′-TGGTGTTAAAATTCCATAGGC-3′ (SEQ ID NO: 5) and 5′-GCTGTATAAAATGTCAAGGCC-3′ (SEQ ID NO: 6) ) . The positions of each primer pair are illustrated in B and C of Figure 1. Primer pair 1 was used to identify the Slc17a6flox genotypes using mousetail samples via the following PCR step-down cycle method: 94℃ for 3 min → (94℃ for 20 s→ 64℃ for 1 min→72℃ for 1.5 min) for 3 cycles → (94℃for 20 s→ 60℃ for 1 min→72℃ for 1.5 min) for 5 cycles → (94℃ for 20 s→56℃ for 1 min→72℃ for 1.5 min) for 27 cycles→72℃ for 10 min → 4℃. The Slc17a6flox genotype of the mice was determined for the behavioral experiments. Outer and inner primer pairs were used for nested PCR to confirm vGlut2 cKO in MCH neurons in the LHA, hippocampus, and cortex from brain slices of mice from the three genotypes: Pmch-Cre; Slc17a6+ / +, Pmch-Cre; Slc17a6flox / +, and Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox. For each round of PCR, we used the following PCR three-step cycle method: 94℃ for 3 min → (94℃ for 20 s→ 60℃ for 30 s→ 72℃ for 3 min) for 35 cycles→72℃ for 10 min →4℃. The PCR product from the first PCR round was used as the DNA template in the second round.

[0113] The PCR products were purified from agarose gels using the FavorPrepTM GEL / PCR purification kit (FAGCK 001; FAVORGEN Biotech, Ping Tung, Taiwan) . Then, these products were subcloned using the Zero BluntTM TOPOTM PCR Cloning Kit (450245; Invitrogen, Waltham, MA, USA) . The linearized and topoisomerase I-activated pCRTM Blunt II-TOPOTMvector and salt solution were mixed with the PCR products, and incubated at room temperature for 10 min and then transformed into Escherichia coli DH5α competent cells following a standard heat shock protocol (in which the cells were thawed on ice, 3 μL of ligation mix was added, the tube was flicked four or five times, the tube containing the cells and ligation mix was placed on ice for 30 min, the cells were then heat shocked by incubating the tube containing them at 42℃ for 45 s, placing it on ice for 5 min, adding 200 μL of Plus Grow II medium, and then incubated it at 37℃ for 1 h) . After the transformation, the cells were plated on LB agar supplemented with kanamycin and incubated at 37℃ for ～16 h. Well-isolated, healthy colonies were picked up and grown in 2 mL of Plus Grow II medium supplemented with 0.1%kanamycin at 37℃ for 1 day. The plasmids were purified using the Cica Geneus Plasmid Prep Kit (08207-96, Kanto Chemical Co., Portland, OR, USA) and confirmed by EcoRI-HF restriction digestion (R3101; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) . Finally, the correct plasmids were sequenced using the M13 forward (5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′ (SEQ ID NO: 7) ) and M13 reverse (5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′ (SEQ ID NO: 8) ) primers.

[0114] Plasmid construction

[0115] Using the CRISPR / Cas9 system to knock out gene (s) of interest with high specificity and minimal off-target effects, we designed single-guide RNAs (sgRNAs) based on CHOPCHOP (https:  / / chopchop. cbu. uib. no / ) . To knockout Slc17a6 gene, two sgRNA candidates were selected to target the following sequences: 5′-CAGGTTACAGCGGATGCCGAAGG-3′ (SEQ ID NO: 9) (in exon 2) and 5′-CGATCCGTGGATCATCCCCACGG-3′ (SEQ ID NO: 10) (in exon 3) . An sgRNA targeting the LacZ gene (target sequence: 5′-TGCGAATACGCCCACGCGATGGG-3′ (SEQ ID NO: 11) ) was used as the control. This gene is not in the mouse genome and has been used in several previous studies5, 6. U6-gRNA (backbone) -CAG-FLEX-mCherry-WPRE was used as the vector plasmid for sgRNA insertion at the SapI site in the sgRNA (backbone) area. This plasmid vector was created by inserting the U6-sgRNA (SapI) fragment of pAAV-U6-sgRNA (SapI) -hSyn-GFP-KASH-bGH (Addgene #60958) into pAAV-CAG-FLEX-mCherry-WPRE (produced in house) . DNA sequencing using the U6 promoter as the template and the forward primer 5′-CTGAGGGCCTATTTCCCATG-3′ (SEQ ID NO: 12) confirmed correct insertion of the sgRNA.

[0116] Production and purification of AAV vectors

[0117] The AAV Helper-free system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) was used to produce all AAV vectors in this study based on the calcium phosphate transfection method. Before transfection, several plates of healthy cultured HEK-293 cells in Dulbecco’s modified Eagle’s medium-high glucose (DMEM; Sigma-Aldrich Merck, Darmstadt, Germany) at 90–95%confluence were prepared. On the day of transfection, a solution of 0.3 M CaCl2 (1 mL / plate) , pAAV containing the gene of interest (10 μg / plate) , pAAV-Capsid (serotype 9; 10 μg / plate) , and pHelper (10 μg / plate) was slowly added to 2×HEPES buffer saline (1 mL / plate) slowly dropwise under continuous vortexing. The mixture was then allowed to stand for ～15min at room temperature and added dropwise to the plates (2 mL / plate) . The DMEM in the plates was changed within 24 h. Three days after transfection, the transfected cells and medium were collected and centrifuged. After discarding the supernatant, the pellet was rinsed with phosphate buffered saline (PBS) , centrifuged, and resuspended in Hank’s balanced salt solution. The cell suspension was then subjected to three to four freeze-thaw cycles to disrupt cells; each cycle consisted of freezing at -80℃ for ≥ 30 min, thawing in a water bath at 37℃ for 3 min, and vortexing at room temperature for 1 min. Subsequently, the cell suspension was centrifuged at 4℃ for 10 min. After transferring the supernatant to a new tube, 1μL of benzonase nuclease was added (0.025 U; Merck, Darmstadt, Germany) , and the mixture was incubated in a water bath at 37℃ for 30 min. The solution was centrifuged at 14, 000 rpm at 4℃ for 10 min several times until the supernatant was sufficiently transparent to be divided into aliquots. Finally, quantitative PCR was performed to titrate the purified AAV. AAV aliquots were stored at -80℃ until use.

[0118] Stereotaxic injection of virus

[0119] Surgeries and injection of AAV were performed on 9-to 10-week-old Pmch-Cre; Rosa26LSL-Cas9 mice using a stereotaxic instrument (David Kopf Instrument, Tujunga, CA, USA) under isoflurane (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) anesthesia (2%for the first 30 min and 1%after that) . After ensuring that the mouse head was fixed firmly by a mouth holder and two ear bars, the scalp was incised, and the skull drilled. The coordinates for the LHA injections in both hemispheres were AP (from Bregma) , -1.5 mm; ML (from midline) , ±0.5 mm; DV (from brain surface) , -5.2 mm; AP, -1.5 mm; ML, ±0.9 mm; and DV, -5.0 mm. Viruses were injected through a pulled glass micropipette with a 50-μm-diameter tip (G150-4; , Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA) using an air pressure injector (Pneumatic PicoPump, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) as follows: a mixture of AAV9-U6-Slc17a6 (sgRNA1) -CAG-FLEX-mCherry (5.5 × 1012 copies / mL) and AAV9-U6-Slc17a6 (sgRNA2) -CAG-FLEX-mCherry (5.5 ×1012 copies / mL) 1: 1 by volume (600 nL / injection) , AAV9-U6-LacZ (sgRNA) -CAG-FLEX-mCherry (600 nL / injection, 4.7 × 1012 copies / mL) and AAV-CAG-FLEX-EGFP (600 nL / injection, 2.2 × 1013 copies / mL) . Each injection was performed at an average rate of ～100 nL / min, and the capillary was left in place for～10 min before it was retracted slowly to avoid viral leakage.

[0120] Immunohistochemistry

[0121] For results shown in Figure 3, the mice were euthanized under deep anesthesia using isoflurane, followed by transcardial perfusion with 25 mL of chilled saline and 25 mL of chilled 10%formalin. Their brains were quickly removed, postfixed by immersion in 10%formalin solution overnight at 4℃, and then for subsequent cryoprotection, they were immersed in 30%sucrose in PBS at 4℃ for at least 2 days or until they had sunk. After freezing in optimal cutting temperature compound (OTC 4583; Sakura Finetek, Osaka, Japan) at -80℃, the brains were sliced coronally using a cryostat (CM3050-S; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) at 40μm thickness and stored in PBS containing 0.05%NaN3 at 4℃ until further staining. For staining, brain slices were washed with buffered protein and detergent to block nonspecific binding (1%bovine serum albumin and 0.25%Triton-X in PBS) three times and incubated with primary antibodies under gentle shaking at 4℃ overnight. The sections were rewashed with blocking buffer (three times) before being incubated with the corresponding secondary antibodies at room temperature for 1 h. The brain slices were mounted on glass slides (PRO-02, Matsunami Glass, Kishiwada, Osaka, Japan) , coverslipped (C024401; Matsunami Glass) , and sealed with nail polish before being examined under a fluorescence microscope (BZ-X710, Keyence, Osaka, Japan) . The following primary antibodies diluted in blocking buffer were used: anti-MCH rabbit antibody (M8440; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) at 1: 1000, anti-GFP mouse antibody (mFX75; Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan) at 1: 1000, and anti-DsRed rabbit antibody (632496; Takara Bio, Shiga, Japan) at 1: 1000. The following secondary antibodies were used: CF488-conjugated donkey antimouse antibody (20014; Biotium, Hayward, CA, USA) at 1: 1000 and CF 594-conjugated donkey antirabbit antibody (20152; Biotium) at 1: 1000. For cell counting, a series containing every fourth brain section of the LHA was examined under a fluorescence microscope (BZ-X710; Keyence) ) . Brain regions were identified using the mouse brain atlas in stereotaxic coordinates by Paxinos and Franklin (second edition) .

[0122] For results shown in Figure 7, the mice were deeply anesthetized and perfused with a 4%paraformaldehyde phosphate buffer solution (09154-85; Nacalai Tesque, Nakagyo, Kyoto, Japan) . The brains were removed from the skull and postfixed in the same fixative overnight at 4 ℃. Subsequently, the brains were cryoprotected in 20%sucrose overnight and frozen. The frozen brains were cut on a cryostat at 40 μm thickness. The floating sections were incubated with primary antibodies overnight at room temperature. The following antibodies were used: anti-GFP goat polyclonal (600-101-215; Rockland Immunochemicals, Pottstown, PA, USA) at 1: 250, anti-vGlut2 rabbit polyclonal (MSFR106310; Frontier Institute, Hokkaido, Japan) at 1: 1,000, anti-vGlut2 guinea pig polyclonal (MSFR106290; Frontier Institute) at 1: 1,000, and anti-DsRed rabbit polyclonal (MSFR101400; Frontier Institute) at 1: 1,000. The sections were then treated with species-specific secondary antibodies conjugated to Alexa Fluor 488 (A32814, A21206, Invitrogen; 706-545-148, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) , 555 (A31572, Invitrogen) , or 647 (706-605-148; Jackson ImmunoResearch Laboratories) for 2 h at room temperature. Mounting medium (P36980, ProLong Glass Antifade Mountain, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) was applied to the sections, which were then mounted with coverslips (C024401; Matsunami Glass) . Structured illumination microscopy (SIM) –super-resolution microscopy (SRM) microimages were obtained using a Zeiss ELYRA 3D-SIM system equipped with an EM-CCD camera (Carl Zeiss) . Before acquiring the SIM–SRM images, precise alignment for the different wavelengths of light was performed using the same mounting medium (ProLong Glass) containing 0.1%Tetraspeck (T7280, 0.2-μm beads; Thermo Fisher Scientific) to correct for unavoidable laser misalignment and optical aberrations, which can lead to the alignment not coinciding at very high resolution. Next, Z-section images were obtained at intervals of 126 nm using a 64× objective lens. The number of pattern rotations of the structured illumination was adjusted to 3 in the ELYRA system. After obtaining all the images, the SIM images were reconstructed and aligned using the channel alignment data. SRM images were analyzed using ImageJ (United States National Institutes of Health, http:  / / rsb. info. nih. gov / ij / ) . The optimal brightness and grayscale pixel values were manually adjusted to provide the sharpest discrimination of the microstructure border. Images were obtained at three unselected locations within the hippocampal CA1 region. The percentage of vGlut2-positive MCH-neuron axons was estimated.

[0123] Memory tests

[0124] General procedure

[0125] For all memory tests, 10-to 12-week-old (Pmch-Cre; Slc17a6+ / +, Pmch-Cre; Slc17a6flox / +, and Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox) mice or 13-to 26-week-old AAV-injected Pmch-Cre; Rosa26LSL-Cas9 mice were subjected to the tests. Two weeks before starting the NOR and OL tests, the mice were separated into single cages. After completing the NOR and OL tests, mice were group-housed again for 5 weeks before starting the three-chamber test. For acclimation, the subject mice were gently handled for 7 days (1 min / day) and habituated to the specific arenas for 3 days (10 min / day) before each memory test. On the habituation and test days, the mice were transferred to the experiment room at least 1 h beforehand. The temperature of the experimental environment was 20.1–22.9 ℃, the humidity was 20–26%, and the behavioral study area was illuminated by indirect diffusion light with an intensity of 12–13 lux measured on the surface of the arena floor. All materials used during the tests were cleaned thoroughly with 70%ethanol before and after each trial to prevent olfactory trails. Mouse behaviors were recorded by a video camera fixed above the arenas. All habituation sessions and tests were performed during ZT 15–24.

[0126] NOR test

[0127] The procedure was adapted from a method previously described elsewhere1. In phase 1 (encoding period) , two identical objects (object A) were placed symmetrically in a blue acrylic arena (width × depth × height, 42 cm × 32 cm × 20 cm; Figure 9A) , and the mice were allowed to explore freely for 10 min. After an intertrial interval (1.5 h, 48 h, or 7 days) in their home cage, in phase 2 (retrieval period) , the mice were returned to the arena to reexplore the objects for 10 min. In this phase, one of the two identical objects was replaced by a different object (object B) at the same position. Exploration was defined as sniffing objects or touching with the head toward objects, excepting behaviors such as biting, standing on the objects, or standing close to the objects without direct interaction. The time spent exploring each object was counted manually, and the discrimination ratio was calculated as (timeB-timeA)  /  (timeA+ timeB) , where timeA and timeB refer to the time the mice spent exploring objects A and B, respectively, in phase 2. Object A was distinguishable from object B in shape, color, and material but nearly equal in size. Object pairs were chosen differently across tests to prevent acquired memory. All the objects were secured to the arena floor by double-sided adhesive tape. In the 48-h or 7-day retention trials, the mice were again habituated to the empty arena 1 day or 2 days before the test day of phase 2, respectively.

[0128] OL test

[0129] The procedure was adapted following a protocol described elsewhere7. Mice were habituated and tested in a white acrylic arena (width × depth × height, 30 cm × 30 cm × 30 cm; Figure 9 (B) ) with black tape stuck to a wall, which served as a spatial cue. In phase 1 (encoding period) , two identical objects (object C) were placed at two corners close to the marked wall of the arena, 6 cm away from the close edges, and the mice were allowed to explore the whole arena freely for 10 min. After an intertrial interval of 1.5 h, in phase 2 (retrieval period) , one object was relocated to the opposite corner, 6 cm away from the close edges, and mice reexplored for 10 min. Exploration was defined as for the NOR test. The discrimination ratio was calculated as (timeCd-timeCs)  /  (timeCd+ timeCs) , where timeCdand timeCs refer to the time mice explored displaced and stationary objects, respectively, in phase 2. Three-chamber test

[0130] The test was designed in accordance with previous studies with modifications8. The arena was a white acrylic box (width × depth × height, 60 cm × 40 cm × 25 cm) that was divided into three equal-sized chambers (width × depth × height, 40 cm × 20 cm × 25 cm; Figure 9C) by two acrylic partitions in which there was an opening (6 cm × 6 cm) located at the central bottom. Two metal grid cups (8 cm × 8 cm × 11 cm) were placed at the center, close to the wall of the two side chambers, and fixed by a water bottle placed above each cup. In the habituation session, all the mice explored the empty arena set with two empty cups. On the test day, in phase 1 (habituation) , the mice were habituated to the arena. Then, in phase 2 (sociability test) , a stranger mouse (S1) was placed inside a cup, and an object was placed inside the other cup. The subject mice were then placed in the middle chamber and allowed to explore the whole arena freely. Finally, in phase 3 (the social novelty test) , the mice reexplored the arena in which the object was replaced by another stranger mouse (S2) . Each phase lasted for 10 min. There was no retention time between phases. Both of the stranger mice had never met the subject mouse and had been habituated inside the cup for 10 min / day for 3 days before the test. The following behaviors were counted manually as stimulus exploration: (i) direct interaction with the stimulus (stranger mouse or object) or body parts of the stimulus protruding from the cup, (ii) sniffing the cups with their nose toward the stimulus or sniffing the base of the cup. Standing still near the cups without interaction, sniffing, or climbing to sniff the water bottles were not counted as stimulus exploration.

[0131] Metabolic measurements

[0132] Pmch-Cre; Slc17a6+ / +, Pmch-Cre; Slc17a6flox / +, and Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice were kept separately in single cages beginning at 4 weeks of age. Every 7 days, the mouse body weight and total weekly consumed food pellet weight (CE-2; CLEA Japan) were measured using an accurate scale to a precision of the nearest 0.1 g and followed up until the mice were 15 weeks old.

[0133] An ARCO-2000 mass spectrometer (Arco Systems; Kashiwa, Chiba, Japan) was used to indirectly measure the daily energy expenditure. Sixteen-week-old mice were separately kept in each individually sealed chamber (width × depth × height, 14 cm × 14 cm × 12 cm) , and the outflow gas from the chamber was controlled and analyzed at the mass flow controller. O2 and CO2 concentrations and respiratory quotient (RQ) were determined and calculated (RQ =volume of CO2 evolved / volume of O2 consumed) . The data were recorded every 5 min. An Actimo-100 N system (Shin, Fukuoka, Japan) was used to record the physical activity (locomotor activity) . This system includes a controller connected to an infrared sensor frame (OD width × depth × height, 50 cm × 40 cm × 7 cm; ID width × depth × height: 34 cm × 24 cm × 7 cm) employed to acquire the animal position. These sensors at 20 mm intervals were scanned once every 0.5 s to measure the movement of the mouse. The sealed transparent chamber was placed in the middle of the frame. The total counts were recorded every 30 min. Two systems were controlled by two independent laptops, and up to 8 mice were recorded simultaneously. Mice were habituated to the sealed chamber for 1 day, and the data recorded over the next 2 days were averaged and used in the analysis. Some food pellet pieces were placed inside the chamber, and water was supplied through a chamber-connecting drain. The metabolic schedule and device settings are illustrated in Figure 10.

[0134] Quantification and statistical analysis

[0135] Statistical analyses were performed and graphs were generated using GraphPad Prism, version 9 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) . Means were compared using paired Student’s t-test, or one-way ANOVA, followed by Tukey’s post-hoc test as specified in Figure legends. p < 0.05 was considered statistically significant.

[0136] Figure 9 shows arena and object positions in the NOR (A) , OL (B) , and three-chamber (C) tests.

[0137] Figure 10 shows schedule for metabolic recording (A) and illustration of the indirect calorimetry system (B) .

[0138] Example 1 Prenatal vGlut2 cKO in MCH neurons improves the ability of mice to recognize novel objects

[0139] We examined whether glutamate released from MCH neurons plays a role in memory performance. We evaluated the effect of selective vGlut2 KO in MCH neurons on NOR using three bigenic mice: Pmch-Cre; Slc17a6+ / +, Pmch-Cre; Slc17a6flox / +, and Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox (A of Figure 1) . Several methods were used to confirm the success of vGlut2 cKO in MCH mice. First, we performed genotyping techniques to detect the excised Slc17a6 sequence in the LHA of Pmch-Cre; Slc17a6flox / + and Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice. Initially, the Slc17a6flox genotype was checked by PCR using mouse tail samples and primer pair 1, in which the forward primer and reverse primers are located upstream and downstream of the second loxP site, respectively (B of Figure 1) . Then, the mice were euthanized and their brains fixed in 10%formalin. Theoretically, where Cre is expressed, exon 2 of the Slc17a6flox allele, flanked between the two loxP sites, is excised. We used nested PCR to increase the specificity of our PCR amplification (C of Figure 1) . The shared forward primer is located upstream of the first loxP site, and the two reverse primers are located downstream of the second loxP site. The product from the first PCR round was used as the DNA template in the second round. We carefully excised the LHA from mouse brain alices to include as many MCH neurons as possible. Cortical and hippocampal areas were used as the controls (D, left of Figure 1) . PCR and electrophoresis yielded 536 and 508 bp bands in the first and second rounds, respectively, which were detected exclusively in the LHA of Pmch-Cre; Slc17a6flox / + and Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice, but not in other brain areas or in Pmch-Cre; Slc17a6+ / + mice (D, right of Figure 1) . After subcloning, these PCR products were sequenced, and the results confirmed that the detected bands were amplicons of the excised Slc17a6flox allele. This finding suggests that the Slc17a6 gene was knocked out in some neuronal populations of the LHA. The amplicons of Slc17a6+ and intact Slc17a6flox were not detected on agarose gels, which could be explained by the limited ability to amplify large amplicons (> 2 kb) from crude genomic DNA. Second, we performed immunohistochemistry (IHC) to confirm the lack of vGlut2 in the axons of MCH neurons. Pmch-Cre; Rosa26LSL-tdTomato; Slc17a6+ / + mice were used as a control group to quantify the vGlut2 expression in the axons of MCH neurons (A, left column of Figure 7) . In this group, 94.56%of MCH-neuron axons observed in the CA1 area of the hippocampus (87 / 92 axons from 3 mice) were positive for vGlut2 (B of Figure 7) . To visualize the axons of MCH neurons in Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice, adeno-associated virus (AAV) -CAG-FLEX-EGFP was injected into the LHA. None of the MCH-neuron axons in the CA1 region coexpressed vGlut2 (0 / 40 axons, from 3 mice; A, middle column, and B of Figure 7) . These data indicate that the Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice exclusively lacked vGlut2 in MCH neurons.

[0140] Next, we tested the mouse memory performance in a NOR test. In this test, after 10 min of exploring two identical objects (phase 1, encoding phase) , the mice were kept in a home cage for 1.5 h. They were then allowed to explore the same environment where one of the identical objects was replaced by a different object (Phase 2, retrieval phase; A of Figure 2) . All mouse genotypes showed an equal preference for the two similar objects and a longer exploration time for the novel object than for the familiar object (B of Figure 2) . Interestingly, Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice had a significantly higher discrimination ratio than that of Pmch-Cre; Slc17a6+ / + mice (F2, 30 = 3.286, p = 0.0435) (C of Figure 2) , suggesting the involvement of glutamate in the regulation of memory by MCH neurons. Although there were no statistically significant differences when compared with Pmch-Cre; Slc17a6flox / +, memory tended to be progressively better from the Pmch-Cre; Slc17a6+ / + to Pmch-Cre; Slc17a6flox / + to Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice. This trend suggests an association between the amount of glutamate released from MCH neurons and memory regulation.

[0141] Figure 1 shows generation and validation of vGlut2 cKO in MCH neurons in mice. A) Generation of Pmch-Cre; Slc17a6+ / +, Pmch-Cre; Slc17a6flox / +, and Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox bigenic mice. Slc17a6+ represents the wild type Slc17a6 allele, and Slc17a6flox represents the Slc17a6 allele in which exon 2 is flanked by two loxP sites. B-D) Workflow confirming vGlut2 cKO in MCH neurons using PCR genotyping. B) Genotyping using mousetail tip samples. The position of primer pair 1 is shown on the left and the gel electrophoresis results on the right. C, D) Genotyping using brain slices. C) The positions of the outer and inner primer pairs used for nested PCR and the lengths of the resulting amplicons. In MCH neurons, exon 2 of the Slc17a6flox allele was excised by Cre between the two loxP sites (lowest panel) . D) Schematic of the different brain areas (cortex, hippocampus, and LHA) from which tissue slices were obtained (left) and the electrophoresis results (right) . The first-round PCR product was used as the DNA template for the second PCR round. bp: base pair.

[0142] Figure 2 shows higher discrimination ratio in Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox than in Pmch-Cre; Slc17a6+ / + mice in the NOR test. A) Schematic illustration of the schedule and the procedure forthe NOR test. B, C) Exploration time (in each phase) and discrimination ratio of the three mouse genotypes in the NOR test. A (L) and A (R) : left and right identical objects in phase 1, respectively; A and B: familiar and novel objects in phase 2, respectively. The number of mice per group is shown in parentheses. The data are presented as dot plots; the bar graphs represent means ± SEM, and differences in the means were evaluated by paired t-test (B) or one-way ANOVA followed by Tukey's post-hoc test (C) ; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001. ns: not significant.

[0143] Figure 7 shows confirmation of vGlut2 cKO in MCH neurons. A) Representative immunohistochemical images at CA1 of hippocampus showing expression of vGlut2 in the axon of MCH neurons of Pmch-Cre; Rosa26LSL-tdTomato; Slc17a6+ / + mice (left column) , but no vGlut2 in axons of MCH neurons of Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox (middle column) and MCH-vGlut2. cKO mice (right column) . B) Quantitative vGlut2 colocalization in the MCH-neuron axon count of each mouse group. The number in the parentheses indicates the total number of MCH-neuron axons observed at the CA1 of the hippocampus (mouse number of each group is 3) . Scale bars: 5 μm.

[0144] Example 2 Inducing acute vGlut2 cKO in MCH neurons using enhanced broad object-related memory in mice

[0145] As shown above, when Pmch-Cre and Slc17a6flox / flox mice were crossed, mice with vGlut2 cKO in MCH neurons showed improved memory in the NOR test. However, vGlut2 cKO was performed at the prenatal stage, and the lack of vGlut2 in MCH neurons might trigger biological compensation during development. The present experiment was unable to exclude the possibility that the unknown compensatory activities affect the memory of affected mice rather than a lack of vGlut2 in MCH neurons.

[0146] To test the hypothesis that acute glutamatergic signaling loss from MCH neurons in mature mice exerts the same effect on memory, we performed vGlut2 cKO by in vivo genome editing using the CRISPR / Cas9 system. To do this, we first generated an MCH neuron-specific Cas9-expressing mouse line by crossing Pmch-Cre mice with Rosa26LSL-Cas9 mice (Pmch-Cre; Rosa26LSL-Cas9; A of Figure 3) . In these mice, Cas9 is coexpressed with the enhanced green flourescent protein (Cas9-EGFP) in the presence of Cre activity. IHC revealed that 98.1 ± 1.6%of MCH-immunoreactive (MCH-ir) neurons expressed Cas9-EGFP, and 98.2 ± 0.8%of Cas9-EGFP cells were MCH-ir neurons (n = 3; B of Figure 3) . These observations demonstrate that the expression of Cas9 was restricted primarily to MCH neurons, ruling out any ectopic expression of Cas9 in other neurons. Next, to induce a vGlut2 cKO by frameshift mutation, we designed two 20-bp sgRNAs targeting the Slc17a6 gene, one of which cleaves exon 2 and the other of which cleaves exon 3 of this gene (C of Figure 3) . A mixture of AAVs carrying two separate sgRNAs (Slc17a6 sgRNA1 and 2) was used to increase the success rate of vGlut2 KO. The LacZ protein, commonly used as a reporter in genetic engineering33, is absent from the mouse genome, so we used sgRNA targeting LacZ as the control in this study. Stereotaxic injections of AAV9-sgRNA-FLEX-mCherry of Slc17a6 (sgRNAs) or LacZ (sgRNA) into the LHA of Pmch-Cre; Rosa26LSL-Cas9 mice (D of Figure 3; hereafter referred to as MCH-vGlut2. cKO or MCH-LacZ mice, respectively) resulted in expression of mCherry in Cas9-expressing neurons (82.0 ± 1.3%and 83.7 ± 1.3%for MCH-LacZ and MCH-vGlut2. cKO mice, respectively; E and F of Figure 3) . In addition, 90.2 ± 2.3%and 90.3 ± 1.5%of mCherry-expressing neurons were positive for Cas9-EGFP after the LacZ (sgRNA) and vGlut2 (sgRNAs) injections, respectively (E and F of Figure 3) . Although sgRNA-expressing AAVs infected the cells in a nonspecific manner and induced sgRNA expression in infected cells, genome editing occurred only in the MCH neurons because a complex of Cas9 and sgRNA was required for this process. As reported above, Cas9 was specifically coexpressed in MCH neurons, so these results excluded any off-target effect in other neurons. According to the IHC results for MCH-vGlut2. cKO mice, none of the MCH-neuron axons in the CA1 were colocalized with the vGlut2 signal (0 / 51 axons from 3 mice; A, right column, and B of Figure 7) . We observed that a large proportion of the MCH neuronal population was infected by AAVs, which was sufficient to assess the effects of the target genes.

[0147] Four weeks after injection, MCH-vGlut2. cKO and MCH-LacZ mice were subjected to a NOR test with a 1.5-h retention between the two phases (A, upper panel of Figure 4) . In this experiment, mice from both groups spent equal amounts of time exploring two identical objects in the encoding period (phase 1) and more time exploring the novel object than the familiar object in the retrieval period (phase 2; A of Figure 8) . The discrimination ratio for MCH-vGlut2. cKO mice was significantly higher than that of MCH-LacZ mice (t14 = 3.127, P =0.0074; B, left of Figure 4) . Therefore, acute glutamatergic signaling loss in MCH neurons also improved memory, similar to prenatal vGlut2 cKO in MCH neurons, and sgRNA targeting LacZ did not affect memory function. These results indicated the role of glutamatergic signaling from MCH neurons in regulating short-term object recognition memory. To elucidate the extent of this effect further, we increased the retention interval to 48 h and 7 days (A, upper panel of Figure 4) . In the 48-h retention trial, the ability to distinguish the novel object from the familiar object was still significantly higher in the MCH-vGlut2. cKO group than in the control group, as shown by the higher discrimination ratio (t15= 2.229, P = 0.0415; B, middle of Figure 4, and B of Figure 8) . The findings indicated that vGlut2 cKO in MCH neurons enhances both short-and long-term memory in the mouse model. Nevertheless, the long-term memory enhancement was not retained beyond 7 days (t14 = 0.407, P= 0.6901; B, right of Figure. 4, and C of Figure 8) .

[0148] We next examined whether location-related memory was also elevated in MCH-vGlut2. cKO mice using the object location (OL) test paradigm7 (A, lower panel of Figure 4) . In this experiment, mice encountered two identical objects in an open arena where black adhesive tape was attached to one wall to serve as a spatial cue for the mice in navigating the environment. After 1.5 h of intertrial retention, one object was moved to another position, and the mice were allowed to re-explore the environment. In this experiment, MCH-vGlut2. cKO mice outperformed MCH-LacZ mice in discriminating the novel location of the object (t15 = 2.145, P= 0.0487; C of Figure 4) by spending more time exploring the displaced object than did MCH-LacZ mice (D of Figure 8) . Together with the results of prenatal vGlut2 cKO in MCH neurons, these data firmly support the role of glutamatergic signaling from MCH neurons in general object-related memory regulation and both short-and long-term perspectives.

[0149] Figure 3 shows the workflow for vGlut2 cKO in MCH neurons specifically using the CRISPR / Cas9 system. A) Generation of Pmch-Cre; Rosa26LSL-Cas9 bigenic mice. B) Quantitative cell counts and representative immunohistochemical images showing the expression of Cas9 exclusively in MCH neurons. C) Construction of a plasmid carrying the sgRNA of interest by inserting the designed sgRNA into the plasmid backbone at the SapI restriction enzyme site (arrowheads) . The image at the bottom shows the Slc17a6 gene construct and cleavage sites for Slc17a6 sgRNAs (arrowheads) . D) AAV injection targets in the LHA. E, F) Representative immunohistochemical images and quantitative cell counts showing the expression of mCherry and Cas9-EGFP in MCH neurons after AAV injection. The data are presented as dot plots; the bar graphs show means ± SEMs. The scale bars: 200 μm in the large images and 50 μm in the small images. hGHpA, human growth hormone poly A signal.

[0150] Figure 4 shows enhancement of the discrimination ratio in the NOR and OL tests after vGlut2 cKO in MCH neurons by CRISPR / Cas9. A) Schematic illustration of the schedule and procedure for the NOR test with different retention periods (upper panel) and the OL test (lower panel) . B, C) Discrimination ratio in the NOR and OL tests, respectively, between the mouse groups. The number of mice per group is shown in parentheses. The data are presented as dot plots; the bar graphs show the means ± SEMs; and differences in the means were evaluated using unpaired t tests; *P < 0.05; **P < 0.01. ns, not significant.

[0151] Figure 8 shows exploration time in each phase of the NOR test with different retention periods (A–C) and OL test (D) between MCH-LacZ and MCH-vGlut2. cKO mouse groups. A (L) , A (R) , C (L) , and C (R) : left and right identical objects in phase 1, respectively; A and B: familiar and novel objects in phase 2, respectively. The data are presented as dot plots; the bar graphs show the means ± SEMs. Differences between the means were evaluated using paired t tests for all graphs except the Wilcoxon matched-pairs signed rank test in phase 2 of MCH-LacZ and phase 1 of MCH-vGlut2. cKO at 48 h retention in (B) ; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; ns: not significant.

[0152] Example 3 vGlut2 cKO in MCH neurons strengthened social recognition memory in mice

[0153] Social memory is critical for the survival and development of animals in their society, especially highly territorial species, such as rodents. We performed a three-chamber test to confirm the possibility of social memory enhancement in mice lacking glutamatergic signaling from MCH neurons (A of Figure 5) . After the habituation session (phase 1) , the mice were tested for their innate preference between a novel conspecific and an inanimate object (phase 2) . The mice in both groups were more interested in exploring the stranger mouse (S1) than the object (P= 0.0001 and P< 0.0001 for MCH-LacZ and MCH-vGlut2. cKO, respectively; B of Figure 5) . Moreover, there were no differences in the amount of time spent exploring S1 (P=0.1327) or the object (P= 0.9696) between the two groups of mice (B of Figure 5) . These results implied that the sociability of the mice, or their social motivation, in both groups was unaffected (either impaired or enhanced) . Subsequently, in phase 3, the object was replaced by another stranger mouse (S2) , and the subject mice were tested for their social novelty and the ability to discriminate the novel conspecific from the familiar conspecific. Both groups spent more time interacting with S2 than S1 (P= 0.0477 and P < 0.0001 for MCH-LacZ and MCH-vGlut2. cKO, respectively; C of Figure 5) , which indicated that the ability to recognize social novelty remained intact in both groups of mice. Interestingly, while there was no difference in S1 exploration between the two groups (P = 0.8626; C of Figure 5) , the amount of time that MCH-vGlut2. cKO mice explored S2 was significantly greater than that of MCH-LacZ (P = 0.0064; C of Figure 5) , which in turn led to a considerably greater ability to discriminate the novel conspecific (t15 = 2.630, P = 0.0189; D of Figure 5) by mice in the MCH-vGlut2. cKO group. All the evidence excluded two possible explanations for the higher discrimination ratio in MCH-vGlut2. cKO mice: (i) the impairment, specifically, of sociability and social novelty in MCH-LacZ mice or (ii) the increase in sociability of MCH-vGlut2. cKO mice. Because acquired social memory is the reference for animals to distinguish novel stimuli from familiar stimuli, a reasonable explanation for the greater ability of MCH-vGlut2. cKO alone to recognize social novelty is that it results from enhanced social recognition memory after vGlut2 cKO from MCH neurons.

[0154] Figure 5 shows enhancement of the discrimination ratio in the three-chamber test after vGlut2 cKO in MCH neurons by CRISPR / Cas9. (A) Schematic illustration of the schedule and the procedure for the three-chamber test. S1, Stranger 1; S2, Stranger 2; and O, Object. B–D) Exploration time in each phase (B, C) , and discrimination ratio between the mouse groups (D) in the three-chamber test. The number of mice per group is shown in parentheses. The data are presented as dot plots; the bar graphs show the means ± SEMs. Differences in the means were evaluated using two-way repeated-measures ANOVA with a  post hoc test (B and C) or unpaired t tests (D) ; *P < 0.05; **P < 0.01, ***P < 0.001; ****P < 0.0001. ns, not significant.

[0155] Example 4 vGlut2 cKO in MCH neurons had no significant effect on mouse body weight or energy expenditure.

[0156] After MCH neuronal ablation, the mice showed metabolic abnormalities, such as reduced fat weight and increased energy consumption. Regarding the contribution of glutamatergic signaling from MCH neurons to these metabolic functions, previous reports showed opposing results despite using the same mouse model (Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox vs. Slc17a6flox / flox) but different Pmch-Cre mouse strains. To resolve this contrariety, we used alternative mouse models (Pmch-Cre; Slc17a6+ / + vs. Pmch-Cre; Slc17a6flox / + vs. Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox) to measure metabolic rate. The body weight and total food intake of the mice were measured weekly from the age of 4 to 15 weeks. In general, there was no significant difference in body weight or weekly caloric intake across all mouse genotypes at almost any time point, except for the lower weight of Pmch-Cre; Slc17a6flox / flox mice compared with Pmch-Cre; Slc17a6+ / + mice at 4 and 5 weeks of age (P = 0.0147 and P = 0.0054, respectively) (A and B of Figure 6) . At 16 weeks of age, the three genotypes also showed no significant difference in oxygen consumption, respiratory quotient, or locomotor activity in 24 h or during the individual light and dark periods (C-H of Figure 6) . These results suggest that glutamate from MCH neurons had little or no apparent effect on body weight or energy expenditure.

[0157] Figure 6 shows no significant effect of vGlut2 cKO in MCH neurons on body weight, oxygen consumption, RQ, or locomotor activity. A, B) Comparison of body weight and food intake between three groups of mice aged from 4 to 15 weeks. Energy expenditure was measured as average daily oxygen consumption (C, D) , RQ (E, F) , and locomotor activity (G, H) at 16 weeks of age among the three mouse genotypes. The number of mice per group is shown in parentheses. The data are presented as dot plots; the bar graphs represent means ± SEM. Differences in means among the groups were determined by one-way ANOVA with a post hoc test (A, B) or a one-way ANOVA (D, F, H) ; *P< 0.05. ns: not significant. Time is Zeitgeber time. References 1. Izawa S, et al. 2019. REM sleep–active MCH neurons are involved in forgetting  hippocampus-dependent memories. Science. 365: 1308-1313. 2. Schneeberger M, et al. 2018. Functional analysis reveals differential effects of glutamate and  MCH neuropeptide in MCH neurons. Mol Metab. 13: 83-89. 3. Sankhe AS, Bordeleau D, Alfonso DIM, Wittman G, Chee MJ. 2023. Loss of glutamatergic  signalling from MCH neurons reduced anxiety-like behaviours in novel environments. J Neuroendocrinol. 35: e13222. 4. Tong Q, et al. 2007. Synaptic glutamate release by ventromedial hypothalamic neurons is part  of the neurocircuitry that prevents hypoglycemia. Cell Metab. 5: 383-393. 5. Swiech L, et al. 2015. In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using  CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33: 102-106. 6. Platt RJ, et al. 2014. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.  Cell. 159: 440-455. 7. Marsh DJ, et al. 2002. Melanin-concentrating hormone 1 receptor-deficient mice are lean,  hyperactive, and hyperphagic and have altered metabolism. Proc Natl Acad Sci. 99: 3240-3245. 8. Rein B, Ma K, Yan Z. 2020. A standardized social preference protocol for measuring social  deficits in mouse models of autism. Nat Protoc. 15:3464–3477.

Claims

1.A method of generating a functional MCH neuron, comprising suppressing an expression or activity of vesicular glutamate transporter 2 (vGlut2) in an MCH neuron.2.The method of claim 1, comprising administration of one or more agents that decrease the activity of vGlut2 in an MCH neuron or the expression of vGlut2 in an MCH neuron.3.The method of claim 1, comprising conditional knocking out (cKO) a gene of vGlut2 or a fragment thereof in an MCH neuron, using homologous recombination, RNA interference (RNAi) , or DNA or RNA guided nucleases.4.The method of claim 1, comprising: (A) introducing a first recombinase recognition sequence into an MCH neuron; (B) introducing, after the Step (A) , a second recombinase recognition sequence into the MCH neuron; and (C) obtaining a transformed subject having the first and second recombinase recognition sequences introduced into the MCH neuron;wherein the recombinase is selected from: Bxb1, phiC31, Cre, VCre, SCre, Dre, Flp, KD, B2, B3, R, or gix; the recognition sequence is loxP, VloxP, SloxP, rox, FRT, RS, or gix; andwherein the subject is a non-human mammal, such as a mouse, a rat, a do, a cat, or a horse, or the subject is a human-being,so that one or more exons of the gene are excised between the first and second recombinase recognition sequences.5.The method of claim 4, further comprising: crossing the transformed mouse or rat with a mouse or rat that conditionally expresses a recombinase, to obtain a conditional modified mouse or rat.6.The method of claim 4, wherein exon 2 and / or exon 3 of the gene is excised between the two loxP sites.7.The method of claim 3, wherein the nuclease is a Transcription Activator-like Effector Nuclease (TALEN) , Zinc Finger Nuclease (ZFN) , or a CRISPR / Cas-associated protein.8.The method of claim 1, comprising expressing in the MCH neuron a CRISPR / Cas-associated protein and a guide RNA (gRNA) targeting a gene of vGlut2, wherein the CRISPR / Cas-associated protein is Cas9, Cas6, dCas9, or Cpf1; andthe guide RNA is a single guide RNA (sgRNA) targeting a sequence in exons of the gene, preferably, exon 2 or exon 3 of the gene.9.The method of claim 8, wherein the sgRNA targets 5’-CAGGTTACAGCGGATGCCGAAGG-3’ (SEQ ID NO: 9) (in exon 2) or 5’-CGATCCGTGGATCATCCCCACGG-3’ (SEQ ID NO: 10) (in exon 3) of the gene.10.A recombinant nucleic acid construct, encoding one or more of the following:(a) recombinase recognition sequence, and / or DNA recombinase; or(b) CRISPR / Cas-associated protein and / or a guide RNA (gRNA) targeting a gene of vGlut2.11.The recombinant nucleic acid construct of claim 10, wherein the recombinase recognition sequence comprises a first recombinase recognition sequence and a second recombinase recognition sequence, and the first and second recombinase recognition sequences are base sequences between which recombination occurs by a DNA recombinase;the DNA recombinase is selected from: Bxb1, phiC31, Cre, VCre, SCre, Dre, Flp, KD, B2, B3, R, or gix;the recognition sequence is loxP, VloxP, SloxP, rox, FRT, RS, or gix;so that one or more exons of the gene are excised between the first and second recombinase recognition sequences.12.The recombinant nucleic acid construct of claim 10, wherein the CRISPR / Cas-associated protein is Cas9, Cas6, dCas9, or Cpf1, and the guide RNA is a single guide RNA (sgRNA) targeting a sequence in exons of the gene, preferably, exon 2 or exon 3 of the gene.13.The recombinant nucleic acid construct of claim 12, wherein the sgRNA targets 5’-CAGGTTACAGCGGATGCCGAAGG-3’ (SEQ ID NO: 9) (in exon 2) or 5’-CGATCCGTGGATCATCCCCACGG-3’ (SEQ ID NO: 10) (in exon 3) of the gene.14.A vector comprising the recombinant nucleic acid construct of any one of claims 10-13.15.A recombinant cell comprising the recombinant nucleic acid construct of any one of claims 10-13, or the vector of claim 14.16.A pharmaceutical composition comprising the recombinant nucleic acid construct of any one of claims 10-13, or the vector of claim 14, or the recombinant cell of claim 15.17.A method for preventing, treating, ameliorating or delaying an onset of at least one of a neurodegenerative disease, cognitive decline and any conditions or symptoms associated therewith in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the recombinant nucleic acid construct of any one of claims 10-13, the vector of claim 14, the recombinant cell of claim 15, or the pharmaceutical composition of claim 16.18.The method of claim 17, wherein the neurodegenerative disease is selected from anxiety, short term memory impairment, long term memory impairment, impaired cognitive function, impaired learning function, oxidative stress or any combination thereof.19.The method of claim 17, wherein the neurodegenerative disease is selected from Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Dementia, cognitive decline, Mild Cognitive Impairment (MCI) , Parkinson's disease with MCI, Huntington's disease, Lewy body disease, Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , Prion disease, Motor neuron disease (MND) , Spinocerebellar ataxia (SCA) , Spinal muscular atrophy (SMA) , Friedreich's Ataxia, multiple sclerosis, Idiopathic Intracranial Hypertension, Cranial neuropathies, Trigeminal neuralgia, frontotemporal dementias (FTD) , Senile Dementia (Dementia NOS) , Motor Neuron Disease, bipolar disorder, or any combination thereof.20.The method of any one of claims 1-9 and 17-19, the recombinant nucleic acid construct of any one of claims 10-13, the vector of claim 14, the recombinant cell of claim 15, or the pharmaceutical composition of claim 16, wherein the DNA recombinase and / or the recombinase recognition sequence are encoded by an expression vector; and / orthe CRISPR / Cas-associated protein and / or the gRNA are encoded by an expression vector, preferably, the expression vector is a virus vector, more preferably, the virus vector is an adenovirus vector, or an adeno-associated virus vector (AAV) , such as AAV1, AAV2, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV. rh39, AAVrh. 43, AAVrh. 8, or AAVrh. 10.21.The method of any one of claims 1-9 and 17-19, the recombinant nucleic acid construct of any one of claims 10-13, the vector of claim 14, the recombinant cell of claim 15, or the pharmaceutical composition of claim 16, wherein the recombinant nucleic acid construct, the vector, the recombinant cell, or the pharmaceutical composition is administrated into lateral hypothalamus area (LHA) and surrounding areas of a brain such as a zona incerta.22.The method of any one of claims 1-9 and 17-19, the recombinant nucleic acid construct of any one of claims 10-13, the vector of claim 14, the recombinant cell of claim 15, or the pharmaceutical composition of claim 16, wherein the recombinant nucleic acid construct, the vector, the recombinant cell, or the pharmaceutical composition is formulated for injection, inhalation, parenteral administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intradermal administration, topical administration, or oral administration.23.Use of the recombinant nucleic acid construct of any one of claims 10-13, the vector of claim 14, the recombinant cell of claim 15, or the pharmaceutical composition of claim 16, in the preparation of a medicament for preventing, treating, ameliorating, or delaying an onset of at least one of a neurodegenerative disease, cognitive decline or any conditions or symptoms associated therewith.

Images