KASP marker primer combination for identification of Leymus chinensis germplasm and its application
By developing the KASP labeling primer combination for slut grass, the cumbersome and high cost problems of slut grass germplasm resource identification are solved, efficient identification of slut grass germplasm resources and fingerprint mapping are achieved, and the accuracy of breeding is improved and the identification efficiency of germplasm resources.
Patent Information
- Application Number
- CN202411382954.3
- Authority / Receiving Office
- CN · China
- Patent Type
- Patents(China)
- Current Assignee / Owner
- Filing Date
- 2024-09-30
- Publication Date
- 2024-12-17
- Estimated Expiration
- 2044-09-30
AI Technical Summary
In the prior art, the identification steps of germplasm resources of germplasm resources are cumbersome, time-consuming and costly. There is a lack of applicable KASP labeling primer combinations, and it is impossible to effectively construct the fingerprint map of germplasm resources of germplasm resources.
A combination of KASP marker primers for identification of germplasm of germplasm was developed. Core SNP markers were developed by 36 pairs of KASP primers to 99 germplasm resources of germplasm resources were developed through dd-RAD simplified genome sequencing data, and the fingerprint map of germplasm was constructed. , realizes efficient identification of germplasm resources.
Through the combination of KASP labeling primers, all participating germplasm resources can be clearly distinguished, the molecular identification steps are simplified, the cost is reduced, the accuracy of breeding is improved, and the authenticity of varieties can be identified and related to germplasm resources can be supported. Relationship identification.
Smart Images
Figure CN118910325B_ABST
Abstract
Description
Technical Field
[0001] The invention belongs to the technical field of plant germplasm resource identification, and particularly relates to a KASP marker primer combination for identifying Leymus chinensis germplasm and an application thereof. Background Art
[0002] Leymus chinensis Leymus chinensis ), also known as alkali grass, is a perennial herb of the genus Leymus of the triticeae family. It is an important native grass species with the characteristics of drought resistance, salt-alkali tolerance, and high nutritional value. It is known as the "king of forage grass" of the Poaceae family and plays an important role in the ecological restoration of grasslands in northern my country and the high-quality development of herbivorous animal husbandry.
[0003] Leymus chinensis is a tetraploid cross-pollinated plant with a large genome and high heterozygosity. Its molecular biological research in China lags far behind rice and corn. In recent years, the demand for Leymus chinensis seeds has been increasing. How to more effectively preserve and develop and utilize the existing Leymus chinensis germplasm resources and accurately and efficiently identify germplasm materials are technical issues that need to be solved to ensure the authenticity of the varieties and the timeliness of variety selection and breeding.
[0004] In recent years, a series of molecular markers such as AFLP, RAPD, and SSR have been widely used in the genetic diversity and fingerprint construction of Leymus chinensis. However, these traditional molecular markers are generally based on gel electrophoresis, which is not only time-consuming but also cumbersome. With the development of high-throughput technology, single nucleotide polymorphism (SNP) molecular markers have the characteristics of low mutation rate, genetic stability, rich sites, high specificity, and easy automation. It can effectively overcome the bottleneck of traditional molecular markers and gradually become the mainstream molecular marker for germplasm resource research. Common SNP detection technologies include genome resequencing, simplified genome sequencing, and gene chips, which are simple and convenient, high-throughput, automated, highly sensitive, and highly accurate.
[0005] KASP, or competitive allele-specific PCR, is a fluorescence-based homologous gene typing technology. Its basic principle is to design specific primers for the SNPs at the target sites, perform marker typing and detection through the specific pairing of SNPs at the end of the primers, and judge the double alleles. Compared with other markers, it has the advantages of simplicity and efficiency, high accuracy, low cost, good compatibility, and suitability for large-scale sample testing. It is not limited by species and environmental conditions and has been widely used in species identification, fingerprint map construction, marker development, fine positioning and molecular breeding related research.
[0006] DNA fingerprint refers to a specific fragment or SNP site in an individual's DNA sequence. DNA fingerprint is an effective method for identifying varieties. It has the advantages of being fast, efficient and highly accurate. It is widely used in germplasm resource identification, plant molecular ID card construction, molecular marker-assisted breeding and germplasm resource genetic diversity research. It also provides a more scientific basis and technical support for the protection and utilization of new plant variety rights.
[0007] In the prior art, there are reports on KASP markers for crops such as rice, corn, and wheat, but there are no reports on available molecular markers for research on Leymus chinensis germplasm resources and breeding, and the reported KASP markers cannot be applied to the identification of Leymus chinensis germplasm resources and the construction of fingerprints. At present, the technical steps for molecular identification of Leymus chinensis are cumbersome, time-consuming, and costly. Therefore, there is an urgent need for a KASP marker primer combination for the identification of Leymus chinensis germplasm resources based on the whole genome of Leymus chinensis, and to construct a fingerprint map of Leymus chinensis germplasm resources. Summary of the invention
[0008] The first purpose of the present invention is to overcome the shortcomings of the prior art and provide a KASP marker primer combination for identifying Leymus chinensis germplasm.
[0009] The first object of the present invention is achieved by the following technical solution: a KASP marker primer combination for identifying Leymus chinensis germplasm, the KASP marker primer combination consists of 36 pairs of KASP primers, and the nucleotide sequences of the KASP primers are shown in the following table:
[0010] Primer Name Forward Primer - 1 Forward Primer - 2 Universal Primer Marker1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTACCTAGTATTGATGACTACGTCGCCSEQ ID NO :1 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTACCTAGTATTGATGACTACGTCGCTSEQ ID NO :2 CTTACTGCTATATCTCCATGCCCTTTGSEQ ID NO :3 Marker2 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGATTCGTTTTCAGTTCCCCATCAGTSEQ ID NO :4 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGATTCGTTTTCAGTTCCCCATCAGASEQ ID NO :5 CATATCAGCCACATTCAACAAGTCTTSEQ ID NO :6 Marker3 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTCTTCTCTTTCTTGCTCTGCTTTCCSEQ ID NO :7 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTCTTCTCTTTCTTGCTCTGCTTTCTSEQ ID NO :8 CATTTTCACACTTGGAGAACAATTGTCSEQ ID NO :9 Marker4 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTGCGTGTGTGATTAGTGCACSEQ ID NO :10 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGCGTGTGTGATTAGTGCATSEQ ID NO :11 TAAAAGTGGAAGCCGCTGGTATSEQ ID NO :12 Marker5 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCTGTACTATGATACAATAATCACAACGCSEQ ID NO :13 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCTGTACTATGATACAATAATCACAACGTSEQ ID NO :14 CGACAACTAGCTATCATATCAAAGAGTATGSEQ ID NO :15 Marker6 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATAGGGAGTATGTCCTTCTGATACCSEQ ID NO :16 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATAGGGAGTATGTCCTTCTGATACASEQ ID NO :17 ACGGAAATGGATACTATCAGAAACGASEQ ID NO :18 Marker7 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTCCCACGTAATCCAGCTCCATTSEQ ID NO :19 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTCCCACGTAATCCAGCTCCATCSEQ ID NO :20 CTCTCCATCACACAGCTCATTTCASEQ ID NO :21 Marker8 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTTGCTTCTTGAGTATGATAGCTCGTTTASEQ ID NO :22 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTTGCTTCTTGAGTATGATAGCTCGTTTGSEQ ID NO :23 GAGTACTCTTCCTACATCCTAAGTATTTCASEQ ID NO :24 Marker9 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGTATGTGTGTAGCAGAGGTTAGTCASEQ ID NO :25 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGTATGTGTGTAGCAGAGGTTAGTCTSEQ ID NO :26 GCATGTGAGGTACTACTAATCAATTCCSEQ ID NO :27 Marker10 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCGCCAAAGCTTTCATTTGAGCCSEQ ID NO :28 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCGCCAAAGCTTTCATTTGAGCASEQ ID NO :29 CAAACGCTTTTTCAAATGGGTGGSEQ ID NO :30 Marker11 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGTCTTTCTCTCCAACTTGTGGTCTSEQ ID NO :31 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGTCTTTCTCTCCAACTTGTGGTCCSEQ ID NO :32 AAATAAGCACGGTACTAAAAGGTCACSEQ ID NO :33 Marker12 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCATGTTATAGATGGTGCTGATGAAGGSEQ ID NO :34 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCATGTTATAGATGGTGCTGATGAAGASEQ ID NO :35 GGAAAAGGGAAAATATTACATCAGGCTSEQ ID NO :36 Marker13 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTCTCCAGGTGCAAGAATTGSEQ ID NO :37 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCTCTCCAGGTGCAAGAATTASEQ ID NO :38 GTTGTCCCTGTGTACTGCAGASEQ ID NO :39 Marker14 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAACAACTTCTTCAACCAATCTCATCTTCCSEQ ID NO :40 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAACAACTTCTTCAACCAATCTCATCTTCGSEQ ID NO :41 GAAACGAATACTGAAGGAATTTGGTATGACSEQ ID NO :42 Marker15 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAGTACAAAGATTCAGTGGCCAASEQ ID NO :43 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGAGTACAAAGATTCAGTGGCCAGSEQ ID NO :44 TAGTCCTAATCTACTCGTCACCGTSEQ ID NO :45 Marker16 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCCTGGTGCTGTATGCTTATAATGGSEQ ID NO :46 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCCTGGTGCTGTATGCTTATAATGCSEQ ID NO :47 ATACCTTGAACTGTAGTACTGCCTCSEQ ID NO :48 Marker17 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATGCCTGCTCTCGGATTCCTACSEQ ID NO :49 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAATGCCTGCTCTCGGATTCCTATSEQ ID NO :50 GCATAACAAGATGTGGAGATGGCSEQ ID NO :51 Marker18 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTGATTGAACGGTTGTCCTTAGACTCASEQ ID NO :52 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTGATTGAACGGTTGTCCTTAGACTCGSEQ ID NO :53 TTGTAGGATTTTTAGTGGATCAAAGGCSEQ ID NO :54 Marker19 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGCTTAAGAGGCATAAGGGTGGAATSEQ ID NO :55 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGCTTAAGAGGCATAAGGGTGGAACSEQ ID NO :56 GTATCAGAGCCATCCTTACTGTAGGSEQ ID NO :57 Marker20 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTCACCAGACACCAGTGAGAGCSEQ ID NO :58 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCACCAGACACCAGTGAGAGTSEQ ID NO :59 TAACGCTATGTTGTCTCGGGAGSEQ ID NO :60 Marker21 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGGCTAGCTTTCATTTCATGCTAAGTAG SEQ ID NO :61 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGGCTAGCTTTCATTTCATGCTAAGTAASEQ ID NO :62 ACATGTTCAAGTAACCAAGTTACCTTTCSEQ ID NO :63 Marker22 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTCAAATCAATCGACGGTGCCGSEQ ID NO :64 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCAAATCAATCGACGGTGCCASEQ ID NO :65 CCATGCCAGCGCTATGTTTTTASEQ ID NO :66 Marker23 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACAGGTTGGCTTCAGTGTGTTACTSEQ ID NO :67 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACAGGTTGGCTTCAGTGTGTTACCSEQ ID NO :68 TGAGTGAGTGCAAAGGTTTTTGAASEQ ID NO :69 Marker24 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCGACAGGAGGCATAGGAAACTSEQ ID NO :70 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCGACAGGAGGCATAGGAAACCSEQ ID NO :71 GACATGCGTGTTGGTTCAGAAASEQ ID NO :72 Marker25 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTTGCTTGTCCATGCATAGATCGSEQ ID NO :73 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTTGCTTGTCCATGCATAGATCASEQ ID NO :74 ACGACAAATGAGAGATGTTCGAGASEQ ID NO :75 Marker26 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTTTGAATTCAGGCATGCAGGCSEQ ID NO :76 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTTTGAATTCAGGCATGCAGGASEQ ID NO :77 TGAAACGGATGGAGTACATGGTTSEQ ID NO :78 Marker27 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGATGCGTGAATAAGAAGTAGAAGGAAAGAGSEQ ID NO :79 GAAGGTCGGAGTCAACGGATGATTGATGCGTGAATAAGAAGTAGAAGGAAAGAASEQ ID NO :80 CTCGTGTATTTATATGCTATAAGGGTGAGSEQ ID NO :81 Marker28 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAAGATCTCGTACTGCGCTCSEQ ID NO :82 GAAGGTCGGAGGTCAACGGATTGGAAGACTCTCGTACTGCGCTTSEQ ID NO :83 CGTCAAAACTTGGTGGATCGACSEQ ID NO 84 Marker29 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCAACCAAGCAACATCTATAAAGGGTSEQ ID NO :85 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCAACCAAGCAACATCTATAAAGGGGSEQ ID NO :86 AATATGTCTTAAAAAGTGTCGGATGCGSEQ ID NO :87 Marker30 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCAATGAAATGAAGCGCAAGTTCTTTTGSEQ ID NO :88 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAATGAAATGAAGCGCAAGTTCTTTTASEQ ID NO :89 GTTCAGACTAAGGTGTAATTGGTATCATSEQ ID NO 90 Marker31 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTTCTAATAGAAGTCCTTCCCATCCGGSEQ ID NO :91 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTCTAATAGAAGTCCTTCCCATCCGASEQ ID NO :92 AGGCAAATTTTATGGTAGTACACAGTCSEQ ID NO :93 Marker32 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACAGCAGGAAACATAAGACCACTCSEQ ID NO :94 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACAGCAGGAAACATAAGACCACTTSEQ ID NO :95 TTGAAGGCTGCAAACACTAAACTAGSEQ ID NO :96 Marker33 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAACTTCATCCGTCCATGTAGCATASEQ ID NO :97 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGAACTTCATCCGTCCATGTAGCATTSEQ ID NO :98 TCGTACTTCACAACAACAAAGCATACSEQ ID NO :99 Marker34 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGTAAGGCTAACTGATTTATATCTGGAAASEQ ID NO :100 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGTAAGGCTAACTGATTTATATCTGGAATSEQ ID NO :101 GGTCCATTGTCATGTCTAATACAGTTAAGASEQ ID NO :102 Marker35 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATGTTGTGCATGCCCTAATAGCAGSEQ ID NO :103 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAATGTTGTGCATGCCCTAATAGCAASEQ ID NO :104 ATGAGATATTGTTGCATGCAAGGAGSEQ ID NO :105 Marker36 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTTGCCGTTGCTAGTATGACACASEQ ID NO:106 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTTGCCGTTGCTAGTATGACACGSEQ ID NO:107 GAGTGAAAATGGGCACACATGTASEQ ID NO :108
[0011] A universal fluorescent tag was added to the 5' end of the KASP labeled primer: GAAGGTGACCAAGTTCATGCT was added to the 5' end of the forward primer sequence-1, and GAAGGTCGGAGTCAACGGATT was added to the 5' end of the forward primer sequence-2.
[0012] The second purpose of the present invention is to overcome the shortcomings of the prior art and provide an application of a KASP marker primer combination for identifying Leymus chinensis germplasm in constructing a fingerprint map of Leymus chinensis germplasm resources.
[0013] The beneficial effects of the present invention are as follows: the present invention develops core SNP markers by simplifying dd-RAD genome sequencing data of 99 Leymus chinensis, and constructs fingerprints of 99 Leymus chinensis based on 36 pairs of core primer KASP markers, and finds that the 36 KASP markers can clearly distinguish all 99 Leymus chinensis germplasm resources tested. A molecular ID card is constructed for germplasm resources through fingerprint construction, making the molecular identification steps simpler, more time-saving, and less costly, and can improve the accuracy of variety breeding, and can also be used for variety authenticity identification and germplasm resource kinship identification. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
[0014] Figure 1 The KASP molecular marker typing of Leymus chinensis germplasm resources in Example 2 of the present invention Figure 1 ;
[0015] Figure 2 The KASP molecular marker typing of Leymus chinensis germplasm resources in Example 2 of the present invention Figure 2 ;
[0016] Figure 3 The KASP molecular marker typing of Leymus chinensis germplasm resources in Example 2 of the present invention Figure 3 ;
[0017] Figure 4 The KASP molecular marker typing of Leymus chinensis germplasm resources in Example 2 of the present invention Figure 4 ;
[0018] Figure 5 The KASP molecular marker typing of Leymus chinensis germplasm resources in Example 2 of the present invention Figure 5 ;
[0019] Figure 6 The KASP molecular marker typing of Leymus chinensis germplasm resources in Example 2 of the present invention Figure 6 . DETAILED DESCRIPTION
[0020] The present invention is described in detail below in conjunction with the accompanying drawings.
[0021] Example 1 Development of 36 pairs of core KASP primers
[0022] 99 Leymus chinensis germplasm resources were collected. All of these 99 Leymus chinensis germplasm materials were planted and preserved in the National Perennial Forage Grass Germplasm Resource Nursery (Hohhot). The germplasm resource numbers and sources of the 99 Leymus chinensis are shown in Table 1.
[0023] Table 1 Number and source of Leymus chinensis germplasm resources
[0024] serial number source serial number source A1 Shuozhou City, Shanxi Province A51 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A2 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A52 Hulunbuir City, Inner Mongolia Autonomous Region A3 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A53 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A4 Lvliang City, Shanxi Province A54 Zhangjiakou City, Hebei Province A5 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A55 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A6 Kent Province, Mongolia A56 Tongliao City, Inner Mongolia Autonomous Region A7 Linfen City, Shanxi Province A57 Bulgan Province, Mongolia A8 Kent Province, Mongolia A58 Haixi Mongolian and Tibetan Autonomous Prefecture, Qinghai Province A9 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A59 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A10 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A60 Hulunbuir City, Inner Mongolia Autonomous Region A11 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A61 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A12 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A62 Jilin City, Jilin Province A13 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A63 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A14 Sukhbaatar Province, Mongolia A64 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A15 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A65 Hulunbuir City, Inner Mongolia Autonomous Region A16 Eastern Province of Mongolia A66 Eastern Province of Mongolia A17 Jinzhou City, Liaoning Province A67 Central Province, Mongolia A18 Hulunbuir City, Inner Mongolia Autonomous Region A68 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A19 Linfen City, Shanxi Province A69 Kent Province, Mongolia A20 Hulunbuir City, Inner Mongolia Autonomous Region A70 Sukhbaatar Province, Mongolia A21 Jinzhou City, Liaoning Province A71 Tongliao City, Inner Mongolia Autonomous Region A22 Eastern Province of Mongolia A72 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A23 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A73 Hulunbuir City, Inner Mongolia Autonomous Region A24 Songyuan City, Jilin Province A74 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A25 Hulunbuir City, Inner Mongolia Autonomous Region A75 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A26 Eastern Province of Mongolia A76 Eastern Province of Mongolia A27 Shihezi City, Xinjiang Uygur Autonomous Region A77 Siping City, Jilin Province A28 Baicheng City, Jilin Province A78 Arkhangai Province, Mongolia A29 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A79 Zhangjiakou City, Hebei Province A30 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A80 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A31 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A81 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A32 Chifeng City, Inner Mongolia Autonomous Region A82 Linfen City, Shanxi Province A33 Linfen City, Shanxi Province A83 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A34 Linfen City, Shanxi Province A84 Jilin City, Jilin Province A35 Eastern Province of Mongolia A85 Hulunbuir City, Inner Mongolia Autonomous Region A36 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A86 Kent Province, Mongolia A37 Hulunbuir City, Inner Mongolia Autonomous Region A87 Xing'an League, Inner Mongolia Autonomous Region A38 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A88 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A39 Mongolian Province A89 Mongolia A40 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A90 Tacheng Prefecture, Xinjiang Uygur Autonomous Region A41 Hulunbuir City, Inner Mongolia Autonomous Region A91 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A42 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A92 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A43 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A93 Yan'an City, Shaanxi Province A44 Hulunbuir City, Inner Mongolia Autonomous Region A94 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) A45 Changchun City, Jilin Province A95 New strains A46 Linfen City, Shanxi Province A96 New varieties of Leymus chinensis from West Ujimqin A47 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A97 New strains A48 Chifeng City, Inner Mongolia Autonomous Region A98 New strains A49 Xilin Gol League, Inner Mongolia Autonomous Region A99 New strains A50 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot)
[0025] 99 Leymus chinensis germplasm resources were sequenced by dd-RAD simplified genome sequencing to obtain the original reads of each sample, and the reads were aligned to the reference genome using bwa mem. The software GATK v4.1.4.1 was used to call SNPs, and high-quality SNPs evenly distributed on 14 chromosomes were selected. High-quality SNPs were screened according to the principles of quality value greater than 30, minimum integrity greater than 0.8, minimum allele frequency greater than 0.05, and polymorphic information content greater than 0.2, and a batch of SNP markers with high polymorphism and good stability were obtained.
[0026] KASP core tag development process:
[0027] The first step is to select a conserved sequence greater than 50 bp before and after the SNP site on the DNA chain on the chromosome;
[0028] In the second step, the following markers were retained: markers with an average depth of more than 5×, a quality value greater than 30, a minimum completeness greater than 0.8, and a minimum allele frequency greater than 0.05;
[0029] The third step was to extract 100 bp of the upstream and downstream sequences of the SNP markers, and then use blast v2.10.1+ software to compare these sequences with the reference genome (the publicly available Leymus chinensis genome), remove markers at multiple positions in the comparison, and retain markers with polymorphic information content (PIC) greater than 0.2;
[0030] Step 4: Use primer design software Primer3 v2.4.0 to design primers for the SNP markers retained in step 3 and convert them into KASP markers;
[0031] In the fifth step, the polymorphism of primers was verified using germplasm materials A95, A96, A97, A98, A99, A2, A10, A30, A50 and A70 (see Table 1). The typing results were screened, and the marker primers with negative control (NTC) deviation or only two typing results were eliminated. A total of 36 pairs of primers with better typing results were retained as core primers. The SNP site information of these core KASP markers is shown in Table 2.
[0032] Table 2 SNP loci information of 36 core KASP markers
[0033] Primer name chromosome Location genotype Primer name chromosome Location genotype Marker1 Chr6 264163057 C / T Marker19 Chr9 156210772 A / G Marker2 Chr2 291871856 A / T Marker20 Chr6 233409688 G / A Marker3 Chr1 49461516 G / A Marker21 Chr2 287840183 C / T Marker4 Chr11 287195749 C / T Marker22 Chr4 417207109 C / T Marker5 Chr8 232098505 C / T Marker23 Chr5 394755294 T / C Marker6 Chr8 343676195 C / A Marker24 Chr6 511653178 T / C Marker7 Chr10 65558863 A / G Marker25 Chr8 222323411 C / T Marker8 Chr2 241331949 A / G Marker26 Chr8 258402348 C / A Marker9 Chr4 396986037 A / T Marker27 Chr9 245514131 G / A Marker10 Chr2 151467425 C / A Marker28 Chr9 415757698 G / A Marker11 Chr5 249350908 A / G Marker29 Chr10 159877082 A / C Marker12 Chr4 189558897 C / T Marker30 Chr14 261831710 C / T Marker13 Chr11 239563056 G / A Marker31 Chr14 475995464 C / T Marker14 Chr5 257808371 G / C Marker32 Chr2 70755828 C / T Marker15 Chr11 70732835 A / G Marker33 Chr7 356063394 T / A Marker16 Chr2 404985801 G / C Marker34 Chr14 517775492 T / A Marker17 Chr11 214331997 G / A Marker35 Chr10 430598201 G / A Marker18 Chr4 286662761 T / C Marker36 Chr14 589305149 T / C
[0034] Step 6, retain markers with polymorphic information content (PIC) greater than 0.2;
[0035] Step 7: Design primers for SNP markers and convert them into KASP markers;
[0036] In the eighth step, the polymorphism of these SNP sites was verified, and 36 pairs of core KASP primers were successfully developed (see Table 3).
[0037] Table 3 36 pairs of Leymus chinensis KASP primers
[0038] Primer name Forward Primer-1 Forward Primer-2 Universal primer Marker1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTACCTAGTATTGATGACTACGTCGCCSEQ ID NO:1 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTACCTAGTATTGATGACTACGTCGCTSEQ ID NO:2 CTTACTGCTATATCTCCATGCCCTTTGSEQ ID NO:3 Marker2 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGATTCGTTTTCAGTTCCCCATCAGTSEQ ID NO :4 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGATTCGTTTTCAGTTCCCCATCAGASEQ ID NO :5 CATATCAGCCACATTCAACAAGTCTTSEQ ID NO :6 Marker3 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTCTTCTCTTTCTTGCTCTGCTTTCCSEQ ID NO :7 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTCTTCTCTTTCTTGCTCTGCTTTCTSEQ ID NO :8 CATTTTCACACTTGGAGAACAATTGTCSEQ ID NO :9 Marker4 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTGCGTGTGTGATTAGTGCACSEQ ID NO :10 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGCGTGTGTGATTAGTGCATSEQ ID NO :11 TAAAAGTGGAAGCCGCTGGTATSEQ ID NO :12 Marker5 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCTGTACTATGATACAATAATCACAACGCSEQ ID NO :13 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCTGTACTATGATACAATAATCACAACGTSEQ ID NO :14 CGACAACTAGCTATCATATCAAAGAGTATGSEQ ID NO :15 Marker6 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATAGGGAGTATGTCCTTCTGATACCSEQ ID NO :16 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATAGGGAGTATGTCCTTCTGATACASEQ ID NO :17 ACGGAAATGGATACTATCAGAAACGASEQ ID NO :18 Marker7 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTCCCACGTAATCCAGCTCCATTSEQ ID NO :19 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTCCCACGTAATCCAGCTCCATCSEQ ID NO :20 CTCTCCATCACACAGCTCATTTCASEQ ID NO :21 Marker8 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTTGCTTCTTGAGTATGATAGCTCGTTTASEQ ID NO :22 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTTGCTTCTTGAGTATGATAGCTCGTTTGSEQ ID NO :23 GAGTACTCTTCCTACATCCTAAGTATTTCASEQ ID NO :24 Marker9 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGTATGTGTGTAGCAGAGGTTAGTCASEQ ID NO :25 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGTATGTGTGTAGCAGAGGTTAGTCTSEQ ID NO :26 GCATGTGAGGTACTACTAATCAATTCCSEQ ID NO :27 Marker10 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCGCCAAAGCTTTCATTTGAGCCSEQ ID NO :28 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCGCCAAAGCTTTCATTTGAGCASEQ ID NO :29 CAAACGCTTTTTCAAATGGGTGGSEQ ID NO :30 Marker11 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGTCTTTCTCTCCAACTTGTGGTCTSEQ ID NO :31 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGTCTTTCTCTCCAACTTGTGGTCCSEQ ID NO :32 AAATAAGCACGGTACTAAAAGGTCACSEQ ID NO :33 Marker12 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCATGTTATAGATGGTGCTGATGAAGGSEQ ID NO :34 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCATGTTATAGATGGTGCTGATGAAGASEQ ID NO :35 GGAAAAGGGAAAATATTACATCAGGCTSEQ ID NO :36 Marker13 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTCTCCAGGTGCAAGAATTGSEQ ID NO :37 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCTCTCCAGGTGCAAGAATTASEQ ID NO :38 GTTGTCCCTGTGTACTGCAGASEQID NO :39 Marker14 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAACAACTTCTTCAACCAATCTCATCTTCCSEQ ID NO :40 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAACAACTTCTTCAACCAATCTCATCTTCGSEQ ID NO :41 GAAACGAATACTGAAGGAATTTGGTATGACSEQ ID NO :42 Marker15 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAGTACAAAGATTCAGTGGCCAASEQ ID NO :43 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGAGTACAAAGATTCAGTGGCCAGSEQ ID NO :44 TAGTCCTAATCTACTCGTCACCGTSEQ ID NO :45 Marker16 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCCTGGTGCTGTATGCTTATAATGGSEQ ID NO :46 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCCTGGTGCTGTATGCTTATAATGCSEQ ID NO :47 ATACCTTGAACTGTAGTACTGCCTCSEQ ID NO :48 Marker17 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATGCCTGCTCTCGGATTCCTACSEQ ID NO :49 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAATGCCTGCTCTCGGATTCCTATSEQ ID NO :50 GCATAACAAGATGTGGAGATGGCSEQ ID NO :51 Marker18 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTGATTGAACGGTTGTCCTTAGACTCASEQ ID NO :52 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTGATTGAACGGTTGTCCTTAGACTCGSEQ ID NO :53 TTGTAGGATTTTTAGTGGATCAAAGGCSEQ ID NO :54 Marker19 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGCTTAAGAGGCATAAGGGTGGAATSEQ ID NO :55 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGCTTAAGAGGCATAAGGGTGGAACSEQ ID NO :56 GTATCAGAGCCATCCTTACTGTAGGSEQ ID NO :57 Marker20 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTCACCAGACACCAGTGAGAGCSEQ ID NO :58 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCACCAGACACCAGTGAGAGTSEQ ID NO :59 TAACGCTATGTTGTCTCGGGAGSEQ ID NO :60 Marker21 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGGCTAGCTTTCATTTCATGCTAAGTAG SEQ ID NO :61 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGGCTAGCTTTCATTTCATGCTAAGTAASEQ ID NO :62 ACATGTTCAAGTAACCAAGTTACCTTTCSEQ ID NO :63 Marker22 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTCAAATCAATCGACGGTGCCGSEQ ID NO :64 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCAAATCAATCGACGGTGCCASEQ ID NO :65 CCATGCCAGCGCTATGTTTTTASEQ ID NO :66 Marker23 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACAGGTTGGCTTCAGTGTGTTACTSEQ ID NO :67 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACAGGTTGGCTTCAGTGTGTTACCSEQ ID NO :68 TGAGTGAGTGCAAAGGTTTTTGAASEQ ID NO :69 Marker24 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCGACAGGAGGCATAGGAAACTSEQ ID NO :70 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCGACAGGAGGCATAGGAAACCSEQ ID NO :71 GACATGCGTGTTGGTTCAGAAASEQ ID NO :72 Marker25 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTTGCTTGTCCATGCATAGATCGSEQ ID NO :73 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTTGCTTGTCCATGCATAGATCASEQ ID NO :74 ACGACAAATGAGAGATGTTCGAGASEQ ID NO :75 Marker26 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTTTGAATTCAGGCATGCAGGCSEQ ID NO :76 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTTTGAATTCAGGCATGCAGGASEQ ID NO :77 TGAAACGGATGGAGTACATGGTTSEQ ID NO :78 Marker27 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGATGCGTGAATAAGAAGTAGAAGGAAAGAGSEQ ID NO :79 GAAGGTCGGAGTCAACGGATGATTGATGCGTGAATAAGAAGTAGAAGGAAAGAASEQ ID NO :80 CTCGTGTATTTATATGCTATAAGGGTGAGSEQ ID NO :81 Marker28 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAAGATCTCGTACTGCGCTCSEQ ID NO :82 GAAGGTCGGAGGTCAACGGATTGGAAGACTCTCGTACTGCGCTTSEQ ID NO :83 CGTCAAAACTTGGTGGATCGACSEQ ID NO 84 Marker29 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCAACCAAGCAACATCTATAAAGGGTSEQ ID NO :85 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCAACCAAGCAACATCTATAAAGGGGSEQ ID NO :86 AATATGTCTTAAAAAGTGTCGGATGCGSEQ ID NO :87 Marker30 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCAATGAAATGAAGCGCAAGTTCTTTTGSEQ ID NO :88 GAAGGTCGGAGTCAACGGAATTTCAATGAAATGAAGCGCAAGTTCTTTTASEQ ID NO :89 GTTCAGACTAAGGTGTAATTGGTATCATSEQ ID NO 90 Marker31 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTTCTAATAGAAGTCCTTCCCATCCGGSEQ ID NO :91 GAAGGTCGGGTCAACGGATTGTTCTAATAGAAGTCCTTCCCATCCGASEQ ID NO :92 AGGCAAATTTTATGGTAGTACACAGTCSEQ ID NO :93 Marker32 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACAGCAGGAAACATAAGACCACTCSEQ ID NO :94 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACAGCAGGAAACATAAGACCACTTSEQ ID NO :95 TTGAAGGCTGCAAACACTAAACTAGSEQ ID NO :96 Marker33 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAACTTCATCCGTCCATGTAGCATASEQ ID NO :97 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGAACTTCATCCGTCCATGTAGCATTSEQ ID NO :98 TCGTACTTCACAACAACAAAGCATACSEQ ID NO :99 Marker34 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGTAAGGCTAACTGATTTATATCTGGAAASEQ ID NO :100 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGTAAGGCTAACTGATTTATATCTGGAATSEQ ID NO :101 GGTCCATTGTCATGTCTAATACAGTTAAGASEQ ID NO :102 Marker35 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATGTTGTGCATGCCCTAATAGCAGSEQ ID NO :103 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAATGTTGTGCATGCCCTAATAGCAASEQ ID NO :104 ATGAGATATTGTTGCATGCAAGGAGSEQ ID NO :105 Marker36 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTTGCCGTTGCTAGTATGACACASEQ ID NO :106 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTTGCCGTTGCTAGTATGACACGSEQ ID NO :107 GAGTGAAAATGGGCACACATTGTASEQ ID NO :108
[0039] The primers in Table 3 are fluorescently labeled primers.
[0040] Example 2 Construction of a fingerprint of Leymus chinensis germplasm resources
[0041] The 36 pairs of KASP primers of the present invention were used to type 99 Leymus chinensis germplasm resources and construct fingerprints. The specific method is as follows:
[0042] 1) Material preparation: 99 Leymus chinensis germplasm resources were selected. These 99 Leymus chinensis germplasm materials were planted and preserved in the National Perennial Forage Grass Germplasm Resource Garden (Hohhot). The germplasm resource numbers and sources of the 99 Leymus chinensis are shown in Table 1;
[0043] 2) DNA extraction: At the seedling stage, young leaves of the above 99 Leymus chinensis germplasm materials were taken into different 2 ml cryopreservation tubes and quickly frozen in liquid nitrogen. After being brought back to the laboratory, DNA was extracted using the high-efficiency plant genomic DNA extraction kit (DP350) of Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd. For detailed steps, refer to the kit instructions;
[0044] 3) Primer synthesis: Universal fluorescent labels were added to the 5' end of each of the 36 pairs of primers: GAAGGTGACCAAGTTCATGCT was added to the 5' end of the forward primer sequence-1, and GAAGGTCGGAGTCAACGGATT was added to the 5' end of the forward primer sequence-2. Primer synthesis was completed at Nanjing Jisi Huiyuan Biotechnology Co., Ltd.
[0045] 4) PCR amplification system: The volume of the PCR amplification system is 5 µL, including 2.5 µL of 2×KASP Mastermix, 1.25 µL of primer mix, 0.1 µL of ROX fluorescent dye and 1.15 µL of DNA template;
[0046] 5) PCR amplification conditions: 5℃ pre-denaturation for 10 min; 95℃ denaturation for 20 sec, 61℃-55℃ annealing and extension for 60 sec, a total of 10 cycles; second round of PCR reaction, 95℃ denaturation for 20 sec, 55℃ annealing and extension for 60 sec, a total of 27 cycles; finally, read the fluorescence information at 25℃ for 30 sec;
[0047] 6) Fluorescence data reading: The reactions of the present invention were all carried out in the Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex real-time quantitative PCR system; the fluorescence FAM was excited at 485 nm and emitted at 520 nm, the HEX was excited at 535 nm and emitted at 556 nm, and the corresponding product fluorescence signal values were taken to complete the genotyping (the one that excited FAM fluorescence was one homozygous genotype, the one that excited HEX fluorescence was another homozygous genotype, and the one that excited both FAM and HEX fluorescence was a heterozygous genotype);
[0048] 7) Fingerprint construction: 99 Leymus chinensis germplasm resources were typed using the 36 KASP markers selected, such as Figure 1-6 The fingerprint map was constructed as shown in Table 4 (Note: black ● indicates heterozygous Allele1 / Allele2; green ■ indicates homozygous Allele1 / Allele1; orange ▲ indicates homozygous Allele2 / Allele2 negative control; blue * is undetermined). The different genotypes in the fingerprint map are: A:A, C:C, T:T, G:G, A:T, A:G, A:C, A:A, C:T, T:C, G:A, G:C, N / N (missing). The fingerprint maps of 99 Leymus chinensis germplasm resources constructed using 36 KASP markers are shown in Table 4.
[0049] Table 4 Fingerprints of 99 Leymus chinensis germplasm resources
[0050] A1 N:N / T:T / G:G / C:C / C:T / C:C / A:G / A:A / A:T / C:C / A:A / T:T / G:G / G:G / N:N / C:C / G:A / C:C / A:A / A:A / C:T / C:C / N:N / C:C / C:C / C:A / A:A / G:G / A:A / C:C / T:T / C:C / T:T / A:A / A:A / C:C A2 C:C / A:T / G:G / C:T / C:C / C:C / A:A / A:A / A:A / C:A / A:A / C:T / G:A / G:G / G:G / G:C / A:A / C:C / A:G / G:G / C:T / C:C / T:T / N:N / C:C / C:A / A:A / N:N / A:A / C:C / C:C / C:C / T:T / A:A / N:N / C:C A3 C:C / A:T / G:A / T:T / T:T / C:C / A:G / A:A / A:T / C:C / A:A / T:T / G:G / G:G / G:G / C:C / G:A / C:C / A:A / G:G / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / C:A / G:G / G:G / C:C / T:T / C:T / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A4 T:T / T:T / G:G / C:T / T:T / C:C / A:G / A:G / A:A / C:A / A:G / C:T / G:A / G:G / G:G / C:C / G:A / C:C / A:A / G:A / C:T / C:C / C:C / C:C / C:C / A:A / A:A / G:G / A:A / C:T / C:T / C:C / T:A / T:A / G:G / C:C A5 C:C / T:T / G:G / N:N / T:T / C:C / A:G / A:A / A:A / A:A / A:A / T:T / G:A / G:C / G:G / C:C / N:N / C:C / A:A / G:A / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / A:A / A:A / C:C / C:C / C:C / T:T / T:T / A:A / G:G / C:C A6 C:T / T:T / G:A / C:T / T:T / C:C / A:A / A:A / A:A / C:A / A:A / C:T / G:G / G:G / N:N / G:G / G:G / C:C / A:A / G:G / N:N / C:C / T:T / N:N / C:C / C:A / A:A / G:G / A:C / N:N / C:T / C:C / T:T / A:A / G:A / T:T A7 C:T / A:T / G:G / C:C / C:T / C:C / A:A / A:G / A:A / C:A / A:A / C:T / G:G / G:G / N:N / C:C / G:G / T:C / A:G / G:G / N:N / N:N / T:T / C:C / C:C / C:A / G:G / G:A / A:C / N:N / C:T / C:T / T:T / A:A / G:G / T:T A8 C:C / A:T / G:A / C:C / T:T / C:C / A:A / A:G / A:T / C:C / N:N / C:T / G:G / N:N / G:G / G:C / G:G / N:N / N:N / G:G / C:C / C:C / T:C / N:N / N:N / C:A / G:G / N:N / A:C / C:C / N:N / C:C / T:T / T:A / G:G / T:T A9 T:T / A:T / G:G / C:T / T:T / C:C / A:A / A:G / A:T / C:C / A:A / T:T / G:G / G:G / A:A / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / C:C / C:C / T:T / T:T / C:T / A:A / A:A / G:A / C:C / C:C / C:C / C:T / T:T / T:A / G:G / C:C A10 N:N / N:N / G:A / C:C / C:T / C:C / A:G / A:G / A:A / C:A / A:G / C:T / G:A / G:G / G:G / G:C / G:A / T:C / A:G / G:A / C:T / C:T / T:C / C:C / C:C / C:A / G:A / G:A / A:A / C:T / C:T / C:C / N:N / A:A / N:N / C:C A11 C:C / T:T / G:A / C:T / C:C / C:C / A:G / A:A / A:A / C:C / A:A / T:T / G:A / C:C / G:G / G:C / G:A / T:T / A:A / G:G / N:N / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / A:A / G:G / A:C / T:T / C:T / T:T / T:T / A:A / G:G / C:C A12 C:T / A:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:G / N:N / A:A / C:A / A:A / N:N / G:A / G:C / G:G / N:N / G:A / T:C / A:G / G:A / C:T / C:C / T:T / C:C / C:T / A:A / A:A / N:N / A:C / C:C / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A13 C:C / A:T / G:G / T:T / C:C / C:C / A:A / A:A / A:A / C:A / A:A / T:T / G:G / G:C / G:G / C:C / G:G / T:C / A:G / G:G / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / C:A / N:N / G:G / A:A / N:N / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / C:C A14 C:C / T:T / G:G / N:N / T:T / C:C / A:G / A:G / A:A / C:C / A:G / C:T / G:G / G:G / A:A / G:C / G:G / C:C / A:A / G:A / C:T / C:C / T:C / C:C / C:C / A:A / G:G / G:G / C:C / C:C / C:T / T:T / N:N / A:A / G:G / C:C A15 C:T / T:T / G:G / T:T / T:T / C:C / A:A / N:N / A:A / C:C / A:A / N:N / G:G / G:G / N:N / N:N / G:G / T:C / A:G / G:A / N:N / C:C / T:T / C:C / C:T / A:A / A:A / G:A / A:C / T:T / C:T / C:C / N:N / A:A / G:G / T:T A16 C:T / A:T / G:G / C:T / T:T / C:C / A:A / A:G / N:N / C:A / A:G / T:T / G:G / G:G / N:N / G:C / G:A / T:C / A:A / G:A / C:T / C:C / T:C / C:C / C:C / A:A / A:A / N:N / N:N / N:N / C:C / C:C / T:T / A:A / G:A / T:T A17 T:T / T:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:G / A:A / A:A / C:C / A:G / C:T / G:G / G:G / G:G / G:G / G:G / C:C / A:A / G:G / C:C / N:N / C:C / C:C / C:C / A:A / G:G / G:G / A:C / T:T / T:T / C:C / T:T / A:A / N:N / T:T A18 C:C / A:T / A:A / N:N / C:T / C:C / A:A / A:A / A:A / C:C / A:A / C:T / G:G / G:G / G:G / N:N / G:A / C:C / A:A / G:G / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / A:A / G:G / A:C / C:C / C:C / C:C / T:A / A:A / G:G / C:C A19 T:T / T:T / G:A / C:C / T:T / N:N / A:A / A:A / A:T / C:A / A:G / T:T / G:G / G:G / G:G / C:C / N:N / T:C / A:A / G:A / C:T / C:C / T:C / C:C / C:C / C:A / G:G / G:G / A:A / C:T / C:T / C:C / T:T / A:A / G:A / C:C A20 C:C / A:T / G:A / C:C / T:T / C:C / A:A / A:G / A:T / C:C / A:G / T:T / G:G / G:G / G:G / G:C / G:G / T:C / A:A / G:G / C:C / C:C / T:C / C:C / C:C / A:A / A:A / G:A / A:A / T:T / C:T / C:C / T:T / A:A / A:A / T:T A21 T:T / N:N / N:N / N:N / T:T / C:C / A:A / A:A / A:A / C:A / A:A / C:T / G:A / G:G / G:G / G:G / G:A / T:C / N:N / G:G / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / G:G / G:G / A:C / C:C / C:C / C:C / T:A / N:N / N:N / C:C A22 C:C / A:T / G:G / C:T / T:T / C:C / A:G / A:G / A:T / C:A / A:G / T:T / G:A / G:G / A:A / C:C / G:A / C:C / A:A / G:G / C:C / C:C / T:C / C:C / C:T / A:A / A:A / G:G / N:N / C:C / C:C / T:T / T:T / A:A / G:G / T:T A23 T:T / A:T / G:A / C:C / T:T / C:C / A:G / A:A / A:A / C:C / A:G / C:T / N:N / N:N / G:G / G:C / N:N / C:C / A:G / G:A / C:T / C:C / T:C / C:C / N:N / C:A / A:A / G:G / C:C / C:C / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / T:C A24 T:T / T:T / A:A / C:T / C:T / C:C / G:G / A:A / T:T / C:C / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / C:C / G:A / C:C / A:A / A:A / C:T / T:T / C:C / T:T / C:C / C:A / A:A / G:A / A:C / C:C / C:C / C:C / N:N / A:A / G:G / C:C A25 C:C / A:A / G:G / T:T / T:T / C:C / A:A / A:A / A:A / A:A / A:G / T:T / G:G / G:G / N:N / N:N / G:G / C:C / A:G / G:G / T:T / C:C / C:C / C:C / C:C / A:A / A:A / G:G / A:A / C:C / C:C / C:C / A:A / A:A / G:A / C:C A26 T:T / T:T / G:G / T:T / C:T / C:C / A:G / A:A / A:A / C:C / A:A / C:T / G:A / G:G / G:G / G:C / G:A / C:C / A:A / G:G / C:T / C:C / N:N / C:C / C:C / C:A / A:A / A:A / C:C / C:C / C:T / C:C / T:A / A:A / G:G / T:T A27 C:C / A:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:G / A:G / A:A / C:A / A:G / T:T / N:N / G:G / G:G / C:C / G:G / T:C / A:A / G:G / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / G:G / G:A / A:A / C:T / C:C / C:C / T:T / A:A / G:A / T:T A28 C:T / A:T / G:A / T:T / C:T / C:C / A:G / A:A / A:A / N:N / A:A / C:T / G:A / G:G / G:G / G:G / G:A / T:C / A:A / G:G / T:T / N:N / T:C / C:C / C:C / A:A / A:A / G:G / A:A / N:N / C:C / C:C / T:A / T:A / G:G / T:C A29 C:T / T:T / G:A / C:T / T:T / C:A / A:G / A:G / A:T / C:C / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / G:A / T:C / A:A / G:G / T:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / A:A / G:A / A:A / N:N / C:C / T:T / T:T / T:A / G:G / T:T A30 C:T / A:A / G:A / C:C / C:T / C:C / A:A / A:G / A:A / C:C / A:A / T:T / G:G / G:G / G:G / C:C / G:A / C:C / A:A / G:A / C:C / C:C / T:T / N:N / C:C / C:A / A:A / N:N / A:C / C:C / C:C / C:C / T:T / A:A / G:A / T:T A31 C:C / A:T / G:G / C:T / T:T / C:C / A:A / A:A / A:A / C:A / A:G / T:T / G:A / G:G / N:N / C:C / G:A / C:C / N:N / G:A / C:T / C:C / T:C / C:C / C:C / A:A / G:G / G:G / A:C / N:N / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A32 C:T / A:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:G / N:N / A:A / C:A / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / C:C / G:A / C:C / A:A / G:A / C:T / C:T / C:C / C:C / C:C / C:A / G:G / G:A / N:N / C:C / C:T / C:C / T:T / A:A / G:G / C:C A33 C:T / A:A / G:G / C:C / T:T / C:C / A:G / A:A / A:A / A:A / G:G / T:T / G:A / G:G / A:A / C:C / G:A / T:C / A:A / G:G / C:T / C:T / T:T / T:C / C:C / C:A / G:A / G:G / A:C / C:C / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A34 C:C / A:A / G:G / C:C / T:T / C:C / A:A / A:A / A:T / C:C / A:A / T:T / G:G / G:C / A:G / C:C / G:A / C:C / A:A / G:G / C:T / C:C / C:C / C:C / C:C / A:A / A:A / G:G / A:A / C:C / C:C / C:C / T:A / A:A / G:G / T:T A35 C:C / T:T / G:A / N:N / T:T / C:C / A:G / A:G / A:T / C:A / A:G / T:T / G:G / G:G / G:G / G:C / G:A / T:C / A:G / G:G / C:T / C:C / T:C / C:C / C:C / A:A / A:A / N:N / A:C / C:C / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A36 T:T / A:T / G:G / C:T / C:C / C:C / A:A / G:G / A:T / C:C / A:G / C:C / G:A / G:G / G:G / C:C / G:A / C:C / A:G / G:A / C:T / C:C / T:T / N:N / C:C / C:A / A:A / G:A / A:A / C:C / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A37 C:C / A:A / G:A / N:N / T:T / C:C / G:G / A:G / A:T / C:A / A:G / T:T / G:G / G:G / G:G / G:G / G:G / C:C / A:A / G:G / N:N / C:T / T:T / C:C / C:C / A:A / G:A / N:N / A:C / C:C / C:T / C:C / T:T / A:A / N:N / T:T A38 C:C / T:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:A / A:A / A:T / C:A / A:A / C:T / G:G / G:G / A:G / C:C / G:G / C:C / A:G / G:G / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / G:G / G:G / A:A / C:C / C:C / C:C / T:T / T:A / G:G / T:T A39 C:C / T:T / G:G / C:C / C:C / C:A / A:A / A:G / A:A / C:C / A:A / T:T / G:G / C:C / G:G / G:G / G:G / T:C / A:A / G:G / C:T / C:C / T:C / N:N / C:C / A:A / G:A / G:G / C:C / C:C / C:C / C:C / N:N / T:A / G:G / T:C A40 C:T / A:T / G:A / C:T / T:T / C:A / A:G / A:A / A:T / C:C / A:A / T:T / G:G / G:C / G:G / G:C / G:G / T:C / A:A / G:G / C:T / C:C / T:T / T:C / C:C / C:A / G:G / G:G / A:C / C:C / C:C / C:C / T:T / A:A / G:A / T:T A41 C:C / A:T / G:G / C:T / T:T / C:C / A:A / A:G / A:T / C:A / A:A / T:T / G:G / G:G / N:N / G:C / G:G / T:C / A:A / G:G / N:N / C:C / N:N / C:C / C:C / C:A / A:A / G:A / C:C / C:C / C:C / C:C / T:A / A:A / G:G / T:T A42 C:C / N:N / G:G / C:C / T:T / C:A / A:A / A:A / A:A / C:A / A:G / T:T / G:G / N:N / G:G / C:C / G:G / T:C / A:A / G:G / C:T / C:C / N:N / C:C / C:C / C:A / G:G / G:A / C:C / C:C / N:N / C:C / T:A / A:A / G:G / C:C A43 C:C / A:T / G:G / N:N / T:T / C:C / A:G / A:G / A:A / C:A / A:A / C:T / G:G / G:G / N:N / G:C / G:G / T:C / A:A / G:G / T:T / C:C / T:C / T:T / C:C / A:A / A:A / G:A / A:C / T:T / C:T / C:T / T:A / A:A / G:A / T:T A44 C:C / T:T / G:G / C:T / T:T / C:A / A:A / G:G / A:A / A:A / A:A / T:T / G:G / G:C / G:G / G:G / G:G / C:C / A:A / G:G / C:C / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / A:A / G:G / C:C / C:C / T:T / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A45 C:C / T:T / G:G / N:N / T:T / C:C / A:A / N:N / A:T / C:A / A:A / T:T / G:G / G:G / G:G / G:C / G:G / C:C / A:A / G:A / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / G:G / G:G / A:C / T:T / T:T / C:T / T:T / T:A / G:A / C:C A46 T:T / A:T / G:G / N:N / T:T / C:C / A:G / A:A / A:A / C:A / A:G / C:T / G:G / G:G / N:N / N:N / N:N / C:C / A:A / G:A / C:T / C:C / T:C / C:C / N:N / C:A / G:G / G:G / A:A / T:T / C:T / C:C / T:T / A:A / G:A / T:T A47 C:C / T:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:A / A:A / A:A / C:A / A:A / T:T / G:A / C:C / G:G / C:C / G:A / C:C / A:A / G:A / T:T / C:C / T:T / T:T / C:C / C:A / G:G / G:A / A:C / C:C / C:T / C:C / T:A / A:A / G:G / C:C A48 N:N / T:T / G:A / C:C / T:T / C:C / A:A / A:G / A:T / C:A / A:A / C:T / G:G / G:C / N:N / G:C / G:G / T:C / A:A / G:A / C:T / C:C / T:C / C:C / C:C / C:A / G:G / G:G / A:A / N:N / C:C / N:N / T:T / A:A / G:G / C:C A49 T:T / A:T / A:A / T:T / C:T / C:C / A:G / A:A / A:A / C:C / A:A / T:T / G:G / G:C / G:G / G:C / G:G / T:T / A:A / G:G / T:T / C:C / T:C / C:C / C:C / C:A / A:A / G:G / N:N / C:C / C:T / C:C / T:T / A:A / G:G / C:C A50 C:T / T:T / G:A / T:T / T:T / C:C / A:A / A:G / A:T / C:A / A:A / C:T / G:G / G:G / G:G / G:C / G:A / C:C / A:A / G:A / C:C / C:C / T:T / C:C / C:C / C:A / G:G / G:G / A:A / T:T / C:T / C:C / T:T / A:A / G:A / T:T A51 C:T / T:T / G:G / T:T / C:T / C:C / A:G / A:A / A:A / C:A / A:G / N:N / G:G / G:C / N:N / G:C / G:G / T:T / A:A / G:A / C:T / C:T / T:T / C:C / C:C / A:A / G:G / G:G / A:C / C:C / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A52 C:T / T:T / G:G / T:T / T:T / C:C / G:G / A:G / A:A / C:C / A:A / C:T / G:G / G:C / G:G / N:N / G:G / C:C / A:A / G:G / C:T / C:C / T:C / C:C / C:C / C:A / G:A / G:A / A:C / C:C / C:T / C:C / T:A / A:A / G:A / T:T A53 C:T / T:T / G:G / C:T / T:T / C:C / A:A / A:G / T:T / N:N / A:A / C:T / A:A / G:G / A:A / G:G / G:A / T:C / A:G / G:A / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / N:N / G:A / A:A / C:C / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / C:C A54 T:T / T:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:A / G:G / A:A / C:C / A:A / C:C / G:G / G:G / N:N / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / T:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / A:A / N:N / N:N / C:C / C:C / T:T / T:T / A:A / G:G / T:T A55 C:T / T:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:G / A:G / A:A / C:C / A:G / C:T / G:G / G:G / G:G / G:G / A:A / T:C / A:A / G:A / N:N / C:C / T:C / T:T / C:C / A:A / A:A / G:A / A:A / C:C / C:C / C:T / T:T / A:A / G:G / C:C A56 C:T / A:T / G:A / N:N / N:N / C:C / A:A / A:A / A:A / C:A / A:G / T:T / G:G / G:G / N:N / G:C / G:A / T:C / A:A / G:A / C:T / C:C / T:C / C:C / C:C / A:A / G:G / G:G / N:N / C:C / N:N / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A57 N:N / A:T / G:A / N:N / C:T / C:C / A:G / A:G / A:A / C:A / A:A / C:T / G:G / G:G / N:N / N:N / G:G / T:C / A:A / G:A / C:T / C:C / T:C / C:C / C:C / C:A / G:A / G:G / A:A / T:T / C:T / C:T / T:T / A:A / N:N / T:T A58 C:C / A:T / G:G / C:C / C:T / C:C / A:G / A:A / A:T / C:A / A:A / T:T / G:G / G:G / G:G / C:C / N:N / C:C / A:A / G:A / T:T / T:T / C:C / C:C / C:T / A:A / A:A / G:A / C:C / C:C / C:C / T:T / T:T / A:A / G:G / N:N A59 C:C / T:T / G:A / C:T / T:T / C:C / A:A / N:N / A:A / C:C / A:G / N:N / G:G / G:C / G:G / C:C / G:G / T:C / G:G / G:G / N:N / C:C / T:T / C:C / C:C / C:A / G:G / G:G / A:C / T:T / C:T / C:C / T:A / T:A / G:A / T:T A60 C:C / A:T / G:A / C:T / T:T / C:C / A:A / A:A / A:A / C:A / A:G / C:T / G:G / G:G / N:N / G:G / G:G / C:C / A:A / G:G / C:C / C:C / C:C / C:C / C:C / C:A / A:A / G:G / A:C / C:C / C:T / C:C / N:N / T:A / G:G / C:C A61 C:C / A:T / G:G / C:T / T:T / C:C / N:N / A:A / A:T / C:A / A:G / T:T / G:A / G:G / G:G / N:N / N:N / T:C / A:G / G:A / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / C:A / G:G / G:G / A:C / T:T / C:T / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A62 T:T / T:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:A / G:G / A:A / C:C / A:A / C:C / G:G / G:G / N:N / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / T:T / C:C / T:T / T:C / C:C / A:A / A:A / G:G / C:C / C:C / C:C / T:T / T:T / A:A / G:G / T:T A63 C:C / T:T / A:A / C:C / T:T / C:C / A:G / A:A / A:T / C:C / A:G / T:T / G:G / N:N / G:G / G:C / G:A / C:C / A:G / G:G / C:T / C:C / T:T / C:C / C:T / A:A / G:G / G:G / A:C / C:C / T:T / C:C / T:T / A:A / G:A / C:C A64 C:T / T:T / G:A / T:T / T:T / C:C / A:A / A:G / A:A / C:C / A:G / T:T / G:G / G:G / A:A / G:G / G:A / T:C / A:A / G:G / C:C / C:C / T:C / C:C / C:C / A:A / A:A / N:N / N:N / T:T / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / C:C A65 C:C / T:T / G:G / T:T / T:T / C:C / A:A / A:A / A:A / C:C / A:G / T:T / G:G / G:G / G:G / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / C:T / C:C / T:C / C:C / C:T / A:A / G:G / G:G / A:C / C:C / C:C / C:C / A:A / A:A / G:A / C:C A66 C:C / A:T / G:G / C:T / T:T / C:C / A:A / A:G / A:T / C:C / A:G / T:T / G:A / G:C / G:G / C:C / G:A / C:C / A:G / G:G / N:N / C:C / T:C / C:C / C:C / A:A / G:G / G:A / C:C / N:N / N:N / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A67 C:C / A:T / G:A / C:T / T:T / C:C / A:A / A:G / A:A / C:C / A:G / T:T / G:G / G:C / N:N / C:C / G:G / T:C / A:A / G:G / N:N / C:C / C:C / C:C / C:C / C:A / G:G / G:A / A:A / C:C / C:C / T:T / N:N / A:A / G:G / C:C A68 C:T / A:T / N:N / C:C / C:T / C:C / A:A / A:A / A:A / C:A / A:A / T:T / G:G / G:G / N:N / C:C / A:A / T:C / A:A / G:G / C:T / N:N / T:C / T:T / C:C / A:A / G:G / G:G / A:A / C:C / C:C / C:C / A:A / A:A / G:A / N:N A69 C:C / A:T / G:A / C:T / T:T / C:A / A:A / A:A / A:T / C:C / A:A / T:T / G:G / G:G / G:G / N:N / G:G / C:C / G:G / G:A / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / G:G / G:G / C:C / C:C / C:C / C:C / T:A / A:A / G:G / C:C A70 C:C / T:T / G:G / C:T / C:T / C:C / G:G / A:A / A:A / C:C / A:A / T:T / G:G / G:C / A:G / G:G / G:G / C:C / A:A / G:G / C:T / C:T / C:C / C:C / C:T / A:A / A:A / G:A / A:A / C:C / C:C / C:C / T:T / A:A / G:A / T:T A71 C:T / A:T / G:A / C:T / N:N / C:C / N:N / A:A / A:T / C:A / A:G / T:T / N:N / G:G / G:G / G:C / G:A / C:C / A:A / G:A / N:N / T:T / T:C / N:N / C:C / N:N / G:A / G:G / A:C / C:C / C:T / C:C / T:T / N:N / G:G / T:C A72 C:T / A:A / G:G / N:N / C:T / C:C / A:A / A:G / A:A / C:C / A:A / T:T / G:G / G:G / N:N / C:C / G:A / C:C / A:A / G:G / C:C / C:C / T:C / C:C / C:C / A:A / G:A / G:G / A:A / C:C / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A73 C:C / T:T / G:A / N:N / T:T / C:C / A:A / A:G / A:T / C:C / A:A / T:T / N:N / G:G / G:G / G:C / G:G / C:C / A:G / G:G / C:C / C:C / T:T / C:C / C:C / C:A / A:A / G:G / A:C / T:T / C:C / C:C / T:A / A:A / G:G / T:T A74 C:C / T:T / G:G / T:T / C:T / C:C / A:G / A:G / A:T / C:A / A:G / T:T / G:A / G:G / G:G / G:C / G:A / T:C / A:G / G:A / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / G:G / G:G / A:C / C:C / C:T / T:T / T:A / A:A / G:G / T:T A75 C:T / T:T / G:G / C:C / C:T / C:A / A:G / A:A / A:A / C:C / A:A / T:T / G:A / G:G / A:G / G:G / G:A / T:C / A:A / G:G / T:T / C:C / T:C / T:C / C:C / A:A / A:A / G:G / A:C / C:C / C:T / C:C / A:A / A:A / G:G / C:C A76 C:T / A:T / G:G / C:C / C:T / C:C / A:G / A:A / A:A / C:C / A:G / T:T / G:G / G:G / G:G / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / C:T / C:C / C:C / C:C / C:C / A:A / A:A / G:G / A:C / C:C / C:C / C:T / T:T / A:A / G:G / C:C A77 C:T / T:T / G:G / T:T / T:T / C:C / A:G / A:G / A:A / C:C / A:A / T:T / G:G / G:G / G:G / C:C / G:A / C:C / A:G / G:G / C:C / C:C / T:C / C:C / C:C / A:A / A:A / G:G / C:C / C:C / C:T / C:C / T:T / A:A / G:G / C:C A78 C:C / T:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:A / A:A / A:T / A:A / A:A / T:T / G:G / G:C / G:G / G:C / G:G / C:C / A:G / G:G / C:C / C:C / T:C / C:C / C:C / A:A / G:A / G:A / A:A / T:T / C:C / C:C / T:A / A:A / G:G / T:C A79 C:C / T:T / G:G / C:C / C:T / C:C / A:G / A:G / A:A / C:C / G:G / T:T / G:G / G:C / G:G / G:C / G:G / C:C / A:G / G:G / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / A:A / G:G / A:A / T:T / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / C:C A80 C:T / T:T / G:G / C:C / C:T / C:C / A:G / A:A / A:T / C:C / G:G / T:T / G:A / G:G / N:N / C:C / G:A / T:C / A:A / G:G / C:C / C:C / T:T / C:C / C:C / C:A / G:G / G:A / A:A / C:C / C:C / C:T / T:T / A:A / G:G / T:T A81 C:T / A:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:A / A:G / A:A / C:C / A:G / C:T / G:G / G:G / G:G / G:G / G:G / T:C / A:A / G:G / C:C / C:C / T:T / C:C / C:C / C:A / A:A / G:G / A:A / C:C / C:C / C:T / T:A / A:A / G:G / T:C A82 C:T / A:T / G:A / C:C / T:T / C:C / A:G / A:G / A:T / C:C / A:G / C:T / N:N / G:G / N:N / G:C / G:A / T:C / A:A / G:G / C:T / C:C / T:C / C:C / C:C / C:A / G:G / G:A / A:A / T:T / C:C / C:T / T:T / A:A / G:G / T:T A83 C:T / T:T / G:G / N:N / T:T / C:C / A:G / A:A / A:A / C:A / A:A / C:T / G:G / G:G / A:A / G:C / G:G / C:C / A:A / G:G / T:T / C:C / T:T / N:N / C:C / C:A / G:G / G:A / A:A / C:C / T:T / C:C / N:N / T:A / G:G / T:C A84 T:T / T:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:G / A:G / A:T / C:C / A:G / C:T / G:A / G:G / A:G / G:G / G:A / T:C / A:G / G:G / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / A:A / G:G / C:C / T:T / C:C / C:C / N:N / T:A / G:A / C:C A85 C:C / N:N / G:G / C:C / C:T / C:C / N:N / A:G / A:T / C:A / A:G / N:N / G:A / G:G / G:G / C:C / G:A / T:C / A:G / G:G / C:T / C:C / N:N / C:C / C:C / C:C / G:A / G:A / A:C / C:C / C:C / C:C / T:A / T:A / G:A / T:T A86 C:C / T:T / G:A / C:T / T:T / C:C / G:G / A:A / A:T / C:A / A:G / T:T / G:G / G:G / G:G / G:C / G:A / T:T / A:A / G:A / C:T / C:C / T:C / N:N / C:C / A:A / G:G / G:G / C:C / C:C / N:N / C:C / T:T / A:A / G:G / C:C A87 C:C / A:T / G:G / C:T / T:T / C:C / A:A / A:G / A:T / C:C / A:A / T:T / G:A / G:C / N:N / C:C / G:A / C:C / A:A / G:A / T:T / C:C / T:C / T:C / C:C / A:A / A:A / G:G / A:A / T:T / N:N / T:T / T:T / A:A / G:A / T:T A88 C:T / T:T / G:G / C:T / T:T / C:A / A:G / A:A / A:T / C:C / A:A / T:T / G:G / N:N / A:A / G:C / G:G / C:C / A:G / G:G / T:T / C:C / T:C / C:C / C:T / A:A / A:A / G:A / A:A / T:T / C:T / C:C / T:T / T:A / G:A / C:C A89 N:N / T:T / G:G / C:C / C:C / C:A / N:N / G:G / A:A / C:C / N:N / T:T / G:G / G:G / G:G / C:C / G:A / T:T / N:N / G:G / T:T / T:T / C:C / C:C / T:T / C:A / N:N / G:A / C:C / N:N / N:N / C:C / N:N / A:A / G:G / C:C A90 C:T / T:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:A / A:A / A:T / C:C / A:A / T:T / G:G / G:C / N:N / G:C / G:G / C:C / A:A / G:A / C:C / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / A:A / G:G / A:A / N:N / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A91 C:C / N:N / G:G / C:T / T:T / C:C / A:A / A:A / A:A / C:A / A:A / C:T / G:G / G:G / N:N / G:C / G:G / T:C / A:A / G:A / C:T / C:C / T:C / C:C / C:T / C:A / G:G / G:G / A:A / T:T / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A92 C:C / N:N / G:G / C:C / T:T / C:C / A:G / A:A / A:T / C:C / A:G / C:T / G:G / G:C / N:N / C:C / G:G / N:N / A:A / G:A / C:C / C:C / T:C / C:C / C:C / C:A / G:G / N:N / A:A / C:T / N:N / C:C / T:T / A:A / N:N / T:T A93 C:T / T:T / G:G / C:T / T:T / C:C / A:A / A:A / A:T / C:A / A:A / T:T / G:G / G:G / N:N / C:C / G:G / C:C / G:G / G:G / T:T / C:T / T:C / C:C / C:C / C:A / A:A / G:G / C:C / N:N / C:T / C:C / T:T / A:A / G:A / T:C A94 C:C / A:T / G:G / C:T / T:T / C:C / A:G / A:A / A:A / C:C / A:A / C:C / G:G / G:G / N:N / C:C / G:G / C:C / N:N / A:A / C:T / C:T / T:T / C:C / C:C / A:A / A:A / G:A / A:C / T:T / C:T / C:C / T:A / A:A / G:A / T:T A95 C:C / A:T / G:A / N:N / T:T / C:C / A:A / A:A / A:A / C:A / A:G / C:T / G:G / G:G / A:A / G:G / G:G / C:C / A:A / G:G / C:C / C:C / C:C / C:C / C:C / C:A / A:A / G:G / A:C / C:C / C:T / C:C / T:A / A:A / G:A / C:C A96 C:T / A:T / G:G / C:T / T:T / C:A / A:G / A:A / A:A / C:C / A:G / C:T / G:G / G:G / G:G / G:G / G:G / C:C / A:G / G:A / C:C / C:C / T:T / C:C / C:C / A:A / G:G / G:G / A:C / C:C / C:T / C:C / T:T / T:A / G:G / T:T A97 C:C / T:T / G:A / C:T / T:T / C:C / A:A / A:A / A:T / C:C / A:G / C:T / G:A / G:G / N:N / C:C / G:A / C:C / A:G / G:A / C:T / C:C / T:C / C:C / C:C / C:A / G:A / N:N / A:A / T:T / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A98 C:T / N:N / G:G / C:T / C:T / C:A / A:A / A:A / A:A / C:A / A:A / C:T / G:G / G:G / N:N / C:C / G:G / C:C / A:G / G:A / C:T / C:C / T:T / C:C / C:C / C:A / G:G / G:G / A:A / C:T / C:C / C:C / T:T / A:A / G:G / T:T A99 T:T / T:T / G:G / C:C / T:T / C:C / A:A / A:A / A:A / C:C / A:A / C:T / G:G / G:G / G:G / C:C / G:A / C:C / A:A / G:A / C:T / C:C / N:N / C:C / C:C / C:A / G:G / G:G / A:A / C:T / C:T / C:T / T:T / T:A / G:A / T:T
[0051] Finally, it should be noted that the above content is only used to illustrate the technical solution of the present invention, rather than to limit the scope of protection of the present invention. Simple modifications or equivalent substitutions of the technical solution of the present invention by ordinary technicians in this field do not deviate from the essence and scope of the technical solution of the present invention.
Claims
1. A KASP marker primer combination for identification of Leymus chinensis germplasm, characterized in that: The KASP marker primer combination consists of 36 pairs of KASP primers, and the nucleotide sequences of the KASP primers are shown in the following table:
2. The KASP marker primer combination for identifying Leymus chinensis germplasm according to claim 1, characterized in that: A universal fluorescent tag was added to the 5' end of the KASP labeled primer: GAAGGTGACCAAGTTCATGCT was added to the 5' end of the forward primer sequence-1, and GAAGGTCGGAGTCAACGGATT was added to the 5' end of the forward primer sequence-2.
3. Application of the KASP marker primer combination for identification of Leymus chinensis germplasm according to claim 2 in constructing a fingerprint map of Leymus chinensis germplasm resources.