Compositions and methods for using peptides to enhance lipid nanoparticles cell transfection

Abstract

Provided is a method of enhancing liquid nanoparticles cell transfection that includes: providing a therapeutical agent; providing a delivery vector, the delivery vector being liquid nanoparticles, comprising a peptide derived from human cofilin, and transporting the therapeutical agent to target cells; and releasing the therapeutical agent in the target cells. Also provided is a peptide includes a sequence that has at least 81.25% identity to SEQ ID NO:1 and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO:1.

Description

COMPOSITIONS AND METHODS FOR USING PEPTIDES TO ENHANCE LIPID NANOPARTICLES CELL TRANSFECTION

[0001] This application claims the right of priority of US provisional Patent Application 63 / 598, 240 filed November 13, 2023, incorporated by reference herein.FIELD OF THE INVENTION

[0002] The present invention relates to compositions and methods for using peptides to enhance lipid nanoparticles cell transfection.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0003] RNA therapeutics, encompassing messenger RNAs (mRNAs) , small interfering RNAs (siRNAs) , and antisense oligonucleotides (ASOs) , have exhibited immense potential in the treatment of diverse human diseases. With over 15 FDA-approved drugs and a multitude of ongoing clinical trials, RNA therapeutics have emerged as a highly valuable approach (Hammond et al., 2021; Corey et al., 2022) . Notably, in the battle against the SARS-CoV-2 pandemic, the mRNA vaccines developed by Pfizer-BioNTech and Moderna have achieved remarkable success (Baden et al., 2021) . Among RNA therapeutics, mRNA stands out due to its exceptional characteristics for drug development. Firstly, mRNA is a long linear RNA that can be easily designed based on genomic sequences and rapidly synthesized using in vitro transcription technology. Secondly, mRNAs enable transient expression of therapeutic proteins without the concern of genomic integration. Additionally, unlike DNA vectors that require transportation into the nucleus, mRNA can initiate protein expression immediately upon transfection into the cytoplasm. Moreover, once an established mature mRNA drug pipeline is in place, subsequent mRNA drugs can be rapidly developed through a well-defined workflow by simply modifying their sequences.

[0004] While small molecule therapeutics traverse the lipid bilayer of the cell membrane, RNA therapeutics, especially mRNAs, face challenges due to their larger size, charge, and hydrophilicity. As a result, they cannot passively diffuse across the cellular membrane and instead rely on endocytosis for cellular uptake. Pure mRNA is seldom used in its "naked" form; instead, a delivery system is employed to safeguard and transport the nucleic acid to target cells. The most commonly utilized delivery systems, including those chosen for currently circulating SARS-CoV-2 vaccines, are mRNA-lipid nanoparticles (mRNA-LNPs) . These LNPs consist of four lipids: (1) an ionizable cationic lipid, (2) 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , (3) cholesterol, and (4) a polyethylene glycol (PEG) -lipid conjugate (Kulkarni et al., 2019a) . These components aid in the formation of uniform nanoparticles, enhance nanoparticle stability, facilitate efficient encapsulation of nucleic acids, assist in cellular uptake, and promote the release of nucleic acid cargo from endosomes (Kulkarni et al., 2018, Kulkarni et al., 2019, Schoenmaker et al., 2021) . However, this process results in approximately 99%of RNA therapeutics becoming trapped within endosomes, which possess a lipid bilayer barrier. Only a minute fraction (1%or less) of the RNA therapeutics can enter the cytoplasm (He et al., 2021, Brown et al., 2020) . Ineffective escape from endosomes require higher dosages, which include but is not limited to the “abundant” mRNA, cationic lipids (which requires a w / w ratio of 15～18: 1 with mRNA) , and mRNA associated impurities such as dsRNAs. Toxicity can arise from both cell-autonomous factors, such as cytotoxicity, and non-cell-autonomous factors, including inflammation. Cytotoxicity can be caused by various factors, including oxidative stress and apoptosis. Therefore, addressing the rate-limiting delivery challenge of endosomal escape in a nontoxic manner is crucial (and thus reduce the adverse effect through lowering the dosage) before RNA therapeutics can be effectively employed in the treatment of widespread human diseases (Dowdy et al., 2022, Dowdy 2017) . To achieve successful delivery of macromolecules into the cytoplasm of cells, three critical steps must be addressed: 1) cell association, 2) stimulation of endocytosis, and 3) facilitation of endosomal escape. Among these steps, the escape of macromolecules from endosomes into the cytoplasm, in a non-cytotoxic manner, is widely recognized as the major bottleneck. Previous studies have indicated that lipid nanoparticles (LNPs) utilize constitutive and inducible pathways, such as clathrin-mediated endocytosis, to enter cells in a cell-type-specific manner (Gilleron et al., 2013, Zurenko et al., 2013) . This suggests that by manipulating and regulating the function of endocytic actin-associated proteins, the delivery of mRNA through LNPs can be significantly improved.

[0005] Endocytosis refers to the process by which various substances are taken up by eukaryotic cells, including plasma membrane proteins and lipids, extracellular molecules, fluids, particles, exosomes, viruses, and bacteria. It is an essential and conserved mechanism that serves diverse functions within cells. Depending on the nature of the cargo and the molecular machinery involved, different types of endocytosis have been identified. These include clathrin-mediated endocytosis, caveolae / lipid raft-mediated endocytosis, clathrin-and caveolae-independent endocytosis, fluid-phase endocytosis, and phagocytosis. Among these pathways, clathrin-mediated endocytosis (CME) is widely regarded as the primary route of endocytosis in mammalian cells (Abouelezz, A et al., 2022) . The process of endocytosis can be divided into several distinct steps. It begins with the membrane undergoing invagination, followed by the formation of coated pits. These pits then become sequestered, and the newly formed vesicle detaches from the membrane. Finally, the newly formed endocytic compartment moves away from the plasma membrane and into the cytosol. These steps are carried out by a complex machinery comprising over 60 proteins, each performing specific tasks. These tasks include membrane bending, recruitment of cargo, scaffolding, lipid modification, and regulation of the cytoskeleton. Recent research has uncovered a wealth of evidence demonstrating strong connections between endocytosis and the actin cytoskeleton. As a result, a specific group of proteins involved in this interplay has been identified and classified as endocytic actin-associated proteins. Notable examples of these proteins include cofilin (Lappalainen et al., 1997) , ARP2 / 3 complex (Sun et al., 2006) , N-WASP (Benesch et al., 2005; Innocenti et al., 2005) , cortactin ( (Merrifield et al., 2005; Sauvonnet et al., 2005; Zhu et al., 2005) , ABP1 (Fazi et al., 2002, Polack et al., 2020, ) , Dynamin (Gilleron et al., 2003) and Myo1E / Myo6 (Kovacs et al., 2006; Salazar et al., 2003) . These proteins play crucial roles in facilitating the dynamic interactions between endocytosis and the actin cytoskeleton.

[0006] Previous studies have demonstrated that pathogenic microbes have evolved molecular mechanisms to manipulate the activity of those endocytic actin-associated proteins to subvert the actin cytoskeletal system in host cells, promoting their internalization into the target cells, modifying the replication niche and facilitating their intracellular and intercellular dissemination. Various pathogens display a wide array of mechanisms to regulate actin dynamic reorganization and to enter, move within or exit from host cells. Certainly, the most impressive and perhaps the most efficient mechanism that nature has evolved to escape the endosome is that of enveloped viruses (Hernandez et al., 1996) . Enveloped viruses are similar in size to LNPs, are taken up into cells by endocytosis, and require an endosomal escape mechanism. In contrast to the dismal<1%endosomal escape of RNA therapeutics, enveloped viruses have a whopping 30%–70%endosomal escape efficiency (Lagache et al., 2012, Staring J, et. Al., 2018) . Cortical actin is the first obstacle encountered by the pathogens upon infection and pathogens have become adept at finding ways overcoming such barrier. Some exploit the pathogen induced receptor-mediated signaling that cause local actin perturbation to transit the cortex, and others have developed remarkable capacities to usurp the receptor-mediated endocytosis followed by pH-dependent / independent fusion from endocytic compartments, through which pathogens pass through the cortex by exploiting intrinsic properties of endocytic vesicles to migrate. These result in a modulation of cofilin activity and coordinated assembly and disassembly of the actin cortex, which thereby facilitates the penetration and migration of microbial pathegens. Viruses have evolved various strategies to overcome the barrier that cortical actin network represents, such as pH independent fusion at the plasma membrane and receptor mediated endocytosis. Once viruses interact with their cellular receptors, intracellular actin-regulating signaling cascades are triggered (Zheng et al., 2016) . A particularly well-studied example is the entry of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1; Balabanian et al., 2004; Cameron et al., 2010; Guo et al., 2011; Yoder et al., 2009) . ) . In non-cycling, resting T cells, interaction between the HIV-1 envelope protein gp120, viral receptor CD4 and co-receptor CXCR4 triggers viral dosage-dependent actin cytoskeleton reorganization and cofilin activity regulation. Entry of HIV-1 induces rapid phosphorylation of cofilin and actin polymerization followed by cofilin dephosphorylation, and subsequent actin depolymerization. Binding of gp120 to CXCR4 triggers fusion and signal transduction that leads to Rac–PAK–LIMK or Rho–ROCK–LIMK-mediated cofilin inactivation and F-actin stabilization and polymerization. This polymerization facilitates CD4 / CXCR4 co-capping and clustering on the cell surface for viral. Subsequent actin activity that is mediated by cofilin activation through CXCR4 signaling increases cortical actin dynamics and actin treadmilling, which promotes the movement of the viral pre-integration complex toward the nuclear region. Consequently, HIV envelope-mediated cofilin activation and actin dynamics are important for the post-entry process that leads to viral nuclear localization. In the resting CD4 T cells of infected patients, HIV-1 induces gradual cofilin dephosphorylation and actin depolymerization, which strikingly resembles the activation of cofilin detected in migratory T lymphoma cells) . As T cells exist in various states of activation, further research should be focused on correlating the state of activation of T cells with the status of cofilin activation, ideally identifying a cell surface marker that is indicative of cofilin activation.

[0007] Cofilin is an actin-binding protein and is function as a severing protein that severs actin filaments (Wang et al., 2007; Huang et al., 2014; Chang et al., 2015) . Cofilin is known as a regulator of actin filament dynamics, it is a small protein of～21 kDA that is ubiquitously expressed in all vertebrates and freely diffuses in eukaryotic cells (Shishkin et al., 2016) . Cofilin promotes the conversion of actin filaments by enhancing the F- actin depolymerization and inhibiting the G-actin polymerization, which are essential in the actin filament dynamics of eukaryotes. The phosphorylation and dephosphorylation of cofilin at the Ser-3 site are crucial mechanisms for actin depolymerization and assembly. Rho GTPase-mediated LIMK phosphorylation inactivates cofilin, while phosphatases SSH and CIN play a reverse role (Huang et al., 2008; Soosairajah et al., 2005) . Once cofilin is activated by dephosphorylation, it servers actin by translocating into the nucleus with binding to actin. As cofilin is the key regulator of actin assembly and disassembly, it comes as no surprise that pathogens interact with cofilin and / or cofilin-regulating signaling pathways to break such barrier and thereby enter into host cells. In a previous study (Yoder et al., 2009) , it was demonstrated that a synthetic peptide (S3) containing the first 16 amino acids of human cofilin, including Ser-3, effectively competed with cofilin for LIMK1. This competition led to the inhibition of cofilin phosphorylation and subsequently activated cofilin. Notably, this activation had a significant impact on viral replication. Numerous other studies have also highlighted the pivotal role of cofilin in regulating the timing and location of actin dynamics. These dynamics play a critical role in facilitating interactions between hosts and pathogens, such as promoting internalization into target cells, preventing fusion between endosomes and lysosomes, and facilitating intracellular dissemination of the pathogens.

[0008] Numerous studies have demonstrated the ability of peptide / protein transduction domains (PTDs) , also known as cell-penetrating peptides (CPPs, Pooga, M et al., 1998) , to facilitate the internalization of macromolecules through endocytosis. The hydrophobic R groups of amino acids have been recognized for their role in viral escape from endosomes. The fortuitous discovery of a cationic delivery peptide, derived from the HIV TAT protein and referred to as a peptide / protein transduction domain (PTD, Ezhevsky, S.A. et al., 1997) or cell-penetrating peptide (CPP) , revolutionized the field of macromolecular therapeutics delivery. The TAT PTD has found widespread use in transporting various macromolecules into diverse cell types, pre-clinical disease models, and clinical trials (Lönn,P et al., 2015, Glogau, R. et al., 2012) , including a significant phase-II study and an ongoing phase-III trial. As a result, the TAT PTD has opened up new avenues for intracellular drug delivery (Lönn,P et al.. 2015, Dupont, E. et al., 2015. Nakase, I. et al., 2013, Koren, E. et al., 2012) . TAT PTD and related PTDs / CPPs deliver macromolecules into cells through endocytosis. TAT PTD achieves cellular uptake through two essential mechanisms: 1) actively inducing macropinocytosis, a specialized form of endocytosis, and 2) facilitating endosomal escape. Lönn et al employed a real-time, quantitative live cell split-GFP fluorescence complementation phenotypic assay to systematically analyze and optimize a series of synthetic endosomal escape domains (EED) . The green fluorescent protein (GFP) is a protein that exhibits bright green fluorescence when exposed to light in the blue to ultraviolet range. Their findings revealed that EEDs containing amino acids with an aromatic phenyl group (Phenyl Alanine) and an indole ring (Tryptophan) a fixed distance of six polyethylene glycol (PEG) units from the TAT-PTD-cargo significantly enhanced cytoplasmic delivery without inducing cytotoxicity. These EEDs address the crucial rate-limiting step of endosomal escape in the delivery of macromolecular biologic peptides, proteins, and RNA therapeutics into cells (Lönn et al., 2016) .

[0009] There is a need for compositions and methods that enhance lipid nanoparticles cell transfection.SUMMARY OF THE INVENTION

[0010] In another embodiment, the present application discloses a method of enhancing liquid nanoparticles cell transfection. The method includes: providing a therapeutical agent; providing a delivery vector, the delivery vector being liquid nanoparticles, comprising a peptide derived from human cofilin, and transporting the therapeutical agent to target cells; and releasing the therapeutical agent in the target cells.

[0011] In another embodiment, the therapeutical agent is messenger RNAs (mRNAs) , small interfering RNAs (siRNAs) , or antisense oligonucleotides (ASOs) .

[0012] In another embodiment, the peptide includes SEQ ID NO: 1; or a sequence that has at least 81.25%identity to SEQ ID NO: 1 and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1.

[0013] In another embodiment, the peptide includes an N-terminus portion and a C-terminus portion; the N-terminus portion comprises SEQ ID NO: 1, or includes a sequence that has at least 81.25%identity to SEQ ID NO: 1 and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1; and the C-terminus portion includes at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine and tryptophan and at least one amino acid selected from the group consisting of glycine, leucine, isoleucine, and valine.

[0014] In another embodiment, the peptide includes an N-terminus portion and a C-terminus portion; the N-terminus portion comprises SEQ ID NO: 1, or includes a sequence that has at least 81.25%identity to SEQ ID NO: 1 and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1; and the C-terminus portion includes at least one amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine, and histidine.

[0015] In another embodiment, the peptide further includes a middle portion. The middle portion is located between the N-terminus portion and the C-terminus portion; and middle portion includes at least one amino acid selected from the group consisting of at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine and tryptophan.

[0016] In another embodiment, the delivery vector further includes an ionizable cationic lipid, 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , cholesterol, and a polyethylene glycol (PEG) -lipid conjugate.

[0017] In one embodiment, the present invention discloses a peptide includes a sequence that has at least 81.25%identity to SEQ ID NO: 1 and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1.

[0018] In another embodiment, the peptide contains three substitution modifications relative to SEQ ID NO: 1.

[0019] In another embodiment, the peptide includes a sequence that has at least 87.5%identity to SEQ ID NO: 1 and contains two substitution modifications relative to SEQ ID NO: 1.

[0020] In another embodiment, the peptide includes a sequence that has at least 93.75%identity to SEQ ID NO: 1 and contains one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1.

[0021] In another embodiment, the peptide includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12.

[0022] In another embodiment, the present application discloses a peptide includes an N-terminus portion and a C-terminus portion. The N-terminus portion includes SEQ ID NO: 1, or comprises a sequence that has at least 81.25%identity to SEQ ID NO: 1 and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1; and the C-terminus portion includes at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine and tryptophan and at least one amino acid selected from the group consisting of glycine, leucine, isoleucine, and valine.

[0023] In another embodiment, the peptide includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 19.

[0024] In another embodiment, the present application discloses a peptide including an N-terminus portion and a C-terminus portion. The N-terminus portion includes SEQ ID NO: 1, or comprises a sequence that has at least 81.25%identity to SEQ ID NO: 1 and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1; and the C-terminus portion includes at least one amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine, and histidine.

[0025] In another embodiment, the peptide further includes a middle portion. The middle portion is located between the N-terminus portion and the C-terminus portion; and middle portion includes at least one amino acid selected from the group consisting of at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine and tryptophan.

[0026] In another embodiment, the peptide includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, and SEQ ID NO: 31.

[0027] It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are intended to provide further explanation of the invention as claimed.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0028] The accompanying drawings, which are included to provide a further understanding of the invention and are incorporated in and constitute a part of this specification, illustrate embodiments of the invention and together with the description serve to explain the principles of the invention.

[0029] In the drawings:

[0030] Figure 1 is a model of AS3-EECs Signaling in Mediating Cofilin Activation and mRNA Endosomal Escape. (A) A Simplified Illustration of AS3-EECs LNP and Its Individual Components. (B) AS3-EECs Signaling in Mediating Cofilin Activation and mRNA Endosomal Escape. The AS3-EECs peptide, which carries the first 16 residues of human cofilin and is conjugated with an endosomal escape domain, effectively competes with cofilin for LIMK1. This competition inhibits cofilin phosphorylation, subsequently activating cofilin. This cofilin activation enhances cortical actin dynamics and actin treadmilling, facilitating endosomal escape and the movement of LNP-encapsulated mRNA towards the cellular translational machinery.

[0031] Figure 2 shows AS3-EECs enhances expression of GFP in 293T cells transfected with GFP mRNA-LNPs. The transfection process was performed by adding varying concentrations of mRNA encapsulated in LNPs: 8 ng / mL, 24 ng / mL, 72 ng / mL, 216 ng / mL, 648 ng / mL, and 1944 ng / mL. After transfection, the cells were harvested at different time points for subsequent analysis. The time points were 48 h, 72 h, and 96 h post-transfection, respectively. The resulting GFP expression level were measured by assessing fluorescence intensity using a flow cytometer. The values are presented as median relative fluorescence intensity (MFI) units.

[0032] Figure 3 shows that AS3-EECs enhances expression of GFP in A549 cells transfected with GFP mRNA-LNPs. The transfection process was performed by adding varying concentrations of mRNA encapsulated in LNPs: 8 ng / mL, 24 ng / mL, 72 ng / mL, 216 ng / mL, 648 ng / mL, and 1944 ng / mL. After transfection, the cells were harvested at different time points for subsequent analysis. The time points were 48 h, 72 h, and 96 h post-transfection, respectively. The resulting GFP expression level were measured by assessing fluorescence intensity using a flow cytometer. The values are presented as median relative fluorescence intensity (MFI) units.

[0033] Figure 4 shows AS3-EECs enhances expression of GFP in B16 cells transfected with GFP mRNA-LNPs. The transfection process was performed by adding varying concentrations of mRNA encapsulated in LNPs: 8 ng / mL, 24 ng / mL, 72 ng / mL, 216 ng / mL, 648 ng / mL, and 1944 ng / mL. After transfection, the cells were harvested at different time points for subsequent analysis. The time points were 48 h, 72 h, and 96 h post-transfection, respectively. The resulting GFP expression level were measured by assessing fluorescence intensity using a flow cytometer. The values are presented as median relative fluorescence intensity (MFI) units.

[0034] DETAILED DESCRIPTION OF THE ILLUSTRATED EMBODIMENTS

[0035] Reference will now be made in detail to embodiments of the present invention, example of which is illustrated in the accompanying drawings.

[0036] Given the critical role of cofilin in the regulation of endocytosis and the actin cytoskeleton, as well as EED in facilitating endosomal escape, we (the inventors of the present application) have prioritized as the focus of the research. To investigate further, the inventors synthesized peptides comprising the first 16 amino acids of human cofilin and conjugated them with a series of endosomal escape domains (AS3-EECs) . AS3-EEC peptides were encapsulated with GFP mRNA within an FDA-approved LNP formulation, and then the GFP mRNA-AS3-EEC LNP were used to transfect various cell types. Following co-incubation of LNPs containing GFP mRNA-AS3-EECs, we measured the fluorescence of transfected cells at different time points using flow cytometry. The results unequivocally demonstrated that the synthetic peptides containing the first 16 amino acids of human cofilin tailed with EEDs, significantly enhanced the transfection efficiency of LNPs-encapsulated mRNA in all cell types tested, including three human cancer cell lines.

[0037] Summary

[0038] RNA therapeutics, which include mRNA, siRNA, and ASOs, have demonstrated remarkable potential in the treatment of various human diseases. Currently, there are more than 15 RNA therapeutics that have received FDA approval, and numerous clinical trials are underway. Notably, mRNA-based vaccines developed by Pfizer-BioNTech and Moderna have been highly successful in combating the SARS-CoV-2 pandemic. Among RNA therapeutics, mRNA stands out due to its unique characteristics, including easy design, rapid synthesis, transient protein expression, and immediate initiation of protein expression in the cytoplasm.

[0039] However, RNA therapeutics face challenges in cellular uptake due to their size and hydrophilicity. To overcome this hurdle, delivery vectors such as mRNA-LNPs (lipid nanoparticles) are utilized, although their escape from endosomes remains a significant obstacle. Successful delivery requires addressing issues such as cell association, stimulation of endocytosis, and facilitation of endosomal escape. In this study, we aimed to explore the potential of peptides derived from cofilin, a protein involved in actin dynamics, to enhance the transfection efficiency of GFP mRNA mediated by LNPs. For this purpose, we designed a series of peptides comprising the first 16 amino acids of human cofilin conjugated with endosomal escape domains, referred to as AS3-EECs. These AS3-EEC peptides were encapsulated into LNPs along with GFP-mRNA. Following transfection of three different human cell lines with the peptide containing LNPs, we evaluated the resulting GFP expression levels by measuring fluorescence intensity using a flow cytometer.

[0040] Our findings indicated that the hydrodynamic diameter of the peptide-containing LNPs ranged from 87.8 nm to 102.1 nm for the different AS3-EEC peptides, slightly larger than the control LNP without peptides. The encapsulation efficiency of mRNA in all three peptide-containing LNPs approached 100%. These LNPs exhibited a uniform size distribution, as indicated by a polydispersity index (PDI) of less than 0.1, and a nearly neutral zeta potential. These results suggest that the encapsulation of cofilin peptides with mRNA did not interfere with the formation of LNPs, maintaining their structural integrity.

[0041] Furthermore, we observed a dose-dependent increase in GFP expression levels as the input of GFP-mRNA was elevated in the three tested cell lines. In 293T cells transfected with 0.2μg / well of GFP-mRNA, the expression levels of GFP increased by 21%, 54%, and 21%for cells transfected with GFP-LNP encapsulated with AS3-EEC1 (SEQ ID NO: 1) , AS3-EEC2 (SEQ ID NO: 2) and AS3-EEC3 (SEQ ID NO: 14) , respectively, compared to LNPs encapsulated with SM102, a commonly used lipid in mRNA-LNPs. Similar trends were observed at 72 and 96 hours post-transfection, with slightly decreased expression levels for AS3-EEC1 and sustained levels for AS3-EEC2 and AS3-EEC3. A549 cells transfected with 0.2μg / well of GFP-mRNA, the highest expression levels of GFP were observed in cells transfected with GFP-LNP encapsulated with AS3-EEC2. At 48, 72, and 96 hours post-transfection, the expression levels were 123%, 50%, and 56%, respectively, compared to SM102. Cells transfected with AS3-EEC1 or AS3-EEC3 exhibited an initial increase in GFP expression levels at 48 hours post-transfection, followed by a decline to similar or slightly lower levels compared to SM102 at later time points. Similar observations were made in B16 cells transfected with 0.2μg / well of GFP-LNP encapsulated with AS3-EEC2. At 48, 72, and 96 hours post-transfection, the expression levels increased by 156%, 60%, and 216%, respectively, compared to SM102. Cells transfected with AS3-EEC1 and AS3-EEC3 showed increased GFP expression levels at 48 hours post-transfection, followed by a decline at 72 hours. However, at 96 hours post-transfection, the expression levels resumed or even increased further compared to SM102.

[0042] In summary, our results demonstrate that peptides derived from cofilin significantly enhance the transfection efficiency of GFP mRNA when encapsulated in LNPs. These findings suggest that cofilin-derived peptides hold potential as valuable tools to improve RNA therapeutics by facilitating their delivery and subsequent protein expression.

[0043] Materials and Methods

[0044] LNP mRNA formulation and characterization. LNPs were prepared using a bottom-up approach with a NanoAssemblr microfluidic apparatus from Precision NanoSystems. To ensure quality control, the lipids were characterized using nuclear magnetic resonance (NMR) .

[0045] In the control group, the Moderna standard formulation was utilized, consisting of SM102, cholesterol, DSPC, and DMG-PEG mixed at a molar ratio of 50: 38: 10: 2 with absolute ethanol in a tube. In the testing group, the peptides AS3-EEC1, AS3-EEC2 or AS3-EEC3 were added at a molar ratio of 2%compared to other components: AS3-EECs: SM102: cholesterol: DSPC: DMG-PEG ratios of 2: 49: 9.8: 37.7: 1.5. The GFP mRNA was diluted in RNase-free 50 mM citrate buffer with a pH of 3.0. The aqueous and ethanol solutions were mixed at a volume ratio of 3: 1, with a mixing rate of 12 ml / min, resulting in LNPs with an mRNA: lipid weight ratio of 10: 1. Subsequently, the lipids were dialyzed overnight using Slide-A-Lyzer G2 dialysis cassettes with a molecular weight cutoff of 10 kD (Thermo Fisher Scientific) . The size of the LNPs was determined by dynamic light scattering (DLS) measurements using a Zetasizer Nano ZS from Malvern Panalytical. Encapsulation efficiency and mRNA concentration were determined using the RiboGreen assay. ζpotential measurements were conducted at a pH of 7.4±0.1 by diluting the LNPs in 1 mM phosphate buffer to achieve a final mRNA concentration of approximately 1-2μg / ml. The pH of the samples was measured after dilution and adjusted, if necessary, using a small volume of 0.1 M NaOH or 0.1 M HCl. These measurements were performed using the Zetasizer Nano ZS instrument. The reported values were calculated using the Smolucho equation, representing the average of three measurements, with the error reported as the standard deviation (SD) .

[0046] Peptide Synthesis

[0047] The peptides were synthesized by Alan Scientific Inc (Gaithersburg) as acetate salts either with the following sequences: Fmoc solid phase peptide synthesis was performed using a Symphony Quartet peptide synthesizer (Ranin) and rink-amide MBHA resin as solid support. Synthesized peptides were cleaved and deprotected using standard conditions (95%TFA with water and TIS) and subsequently precipitated using cold diethylether. Prep-scale RP-HPLC with an Agilent Prep C18 mm column was used to for purification and peptide purity and size was confirmed by mass spectrometry usingα-CHCA matrix (Voyager, Applied Biosystems DE-Pro MALDI-TOF) . Peptides were then lyophilized and resuspended in 10mM DMSO and stored at-20℃ for short term or at-80℃ for long term.

[0048] Cell culture, and transfections analysis. The 293T, B16, and A549 cell lines were obtained from ATCC. These cells were cultured in DMEM supplemented with 10%FBS, 100 U / ml penicillin, and 100 U / ml streptomycin. For experimental purposes, the cells were seeded at a density of 2×105 cells per well in a 96-well plate, with each well containing200μl of growth medium. To deliver GFP mRNA to the cells, LNPs were employed. The transfection process was preformed by adding varying concentrations of mRNA encapsulated in LNPs: 8 ng / mL, 24 ng / mL, 72 ng / mL, 216 ng / mL, 648 ng / mL, and 1944 ng / mL. After transfection, the cells were harvested at different time points for subsequent analysis. Specifically, the time points were 48 h, 72 h, and 96 h post-transfection, respectively. In the experiment, the lipofectamine 2000 was used as positive control for viability of GFP mRNA.

[0049] Flow Cytometry

[0050] Analysis of GFP expression was carried out on Coulter Epics XL flow cytometer. Cells were trypsinised at appropriate time after transfection, washed with phosphate-buffered saline (PBS) and then fixed in 2%paraformaldehyde. GFP was excited using 488nm line of an Argon laser, and emitted light collected at 520 mm(green fluorescence) and 575 nm (red fluorescence) to enable correction for autoflorescence by diagonal gating. Background fluorescence and autofluorescence were determined using mock tested cells. Cellular debris showing reduced side-and forward-scatter was excluded from analysis. Values are presented as median relative fluorescence intensity (MFI) units.

[0051] Results

[0052] Physicochemical and Structural Characterization of LNPs.

[0053] To explore the potential of peptides derived from cofilin in enhancing the transfection efficiency of GFP mRNA mediated by LNPs, we employed a formulation consisting of SM102, cholesterol, DSPC, and PEG-DMG at a molar ratio of 2: 49: 9.8: 37.7: 1.5 to encapsulate both the GFP mRNA and the peptides. We then compared the physicochemical and structural properties of these peptide-containing LNPs with LNPs prepared using an FDA-approved lipid formulation of SM102, cholesterol, DSPC, and PEG-DMG at a molar ratio of 50: 38: 10.5: 1.5, which is widely regarded as the gold standard for RNA-LNP therapy.

[0054] The LNPs were prepared using the NanoAssemblerTM micromixer, a microfluidic mixing method that ensures high inter-batch reproducibility and intra-batch uniformity of the LNPs. The hydrodynamic diameter of the peptide-containing LNPs was measured to be 97.2 nm for AS3-EEC1, 88.1 nm for AS3-EEC2, and 102.1 nm for AS3-EEC3, slightly larger than the no-peptide control, which measured 87.8 nm. The encapsulation efficiency of mRNA in all three peptide-containing LNPs was close to 100%. These LNPs exhibited a uniform size distribution, as indicated by a polydispersity index (PDI) of less than 0.1, and a nearly neutral zeta potential. These results suggest that the encapsulation of cofilin peptides with mRNA did not interfere with the formation of LNPs, maintaining their structural integrity.

[0055] Peptides activating cofilin improve the transfection efficiency of GFP mRNA through LNPs.

[0056] Efficient transfection using the FDA-approved LNP formulation remains a challenging task. Thus, our objective was to explore the potential improvement by modulating the endocytic actin-associated proteins, specifically cofilin. We aimed to regulate cofilin activity by manipulating upstream signals. In human cells, cofilin is inhibited through phosphorylation at Ser-3, which is controlled by the basal activity of LIM family protein kinases (LIMK) . To inhibit the cofilin phosphorylation, we developed a peptide, called AS3 containing the N-terminal 16 residues that include Ser-3 of human cofilin. These peptides were designed to compete with cofilin for LIMK1. In order to change its hydrophobicity to enhance encapsulation efficiency, we introduced a series of substitution mutations at the C-terminus of the AS3 peptide (Seq ID NO: 1 to Seq ID NO: 12) . Additionally, endosomal escape domain were conjugated at C-terminus of AS3 (Seq ID NO: 12 to Seq ID NO: 31) , which were deigned as AS3-EECs. Subsequently, we encapsulated AS3s or AS2-EECs into LNP along with GFP-mRNA. After transfection of three human cell lines with LNPs, the resulting GFP expression level were measured by assessing fluorescence intensity using a flow cytometer.

[0057] As shown in figure 2, the expression level of GFP showed a dose-dependent increase as the input of GFP-mRNA was elevated. In 293T cells with 0.2μg / well of GFP-mRNA, compared to SM102, the expression levels of GFP were observed to increase by 21%, 54%, and21%in cells transfected with GFP-LNP encapsulated SM102-AS3-EEC1, SM102-AS3-EEC2, and SM102-AS3-EEC3, respectively, at 48 h post-transfection. At 72 and 96 hours post-transfection, the expression levels remained similar to those at 48 h for SM102-AS3-EEC2, and SM102-AS3-EEC3, but slightly decreased by 9%for SM102-AS3-EEC1 compared to SM102.

[0058] As shown in Figure 3, in A549 cells transfected with 0.2μg / well of GFP-mRNA, the highest expression levels of GFP were observed in cells transfected with GFP-LNP encapsulated SM102-AS3-EEC2. The expression levels were 123%, 50%, and 56%at 48 hours, 72 h, and 96 hours post-transfection, respectively, compared to SM102. In cells transfected with SM102-AS3-EEC1 or SM102-AS3-EEC3, the expression level of GFP increased by approximately 30%at 48 h post-transfection and then declined to a similar level or slightly lower compared to SM102.

[0059] As shown in Figure 4, similar to the observations in A549 cells, the highest expression level of GFP were observed in B16 cells transfected with 0.2μg / well of GFP-LNP encapsulated SM102-AS3-EEC2. At 48 h, 72 h, and 96 h post-transfection, the expression levels increased 156%, 60%, and 216%, respectively, compared to SM102. Cells transfected with GFP-LNP encapsulated SM102-AS3-EEC1 and SM102-AS3-EEC3 showed an increase in GFP expression levels by 31%and 55%, respectively, at 48 hours post-transfection. However, at 72 h, the expression levels declined to-13%and 2%, respectively, compared to SM102. At 96 h, the expression levels increased again by 35%and 77%, respectively, compared to SM102. A similar temporal pattern of changes in GFP expression was observed in cells transfected with the three different AS3. The expression levels increased at 48 hours post-transfection, followed by a noticeable decline at 72 hours post-transfection. However, at 96 hours post-transfection, the expression levels resumed or even increased further compared to SM102.

[0060] The experiments and results of peptides AS3-EEC1 (SEQ ID NO: 1) , AS3-EEC2 (SEQ ID NO: 2) are AS3-EEC3 (SEQ ID NO: 14) are described above in detail in the present application. Experiments of other peptides (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31) can be conducted in the same way as peptides AS3-EEC1 (SEQ ID NO: 1) , AS3-EEC2 (SEQ ID NO: 2) are AS3-EEC3 (SEQ ID NO: 14) , and similar results can be achieved.

[0061] It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention. Thus, it is intended that the present invention cover the modifications and variations of this invention provided they come within the scope of the appended claims and their equivalents.

[0062] References:

[0063] Abouelezz, A., Almeida-Souza. L.. 2022. The mammalian endocytic cytoskeleton. European J. of Cell Biology. 101, 1-10.

[0064] Baden, L.R., El Sahly, H.M., B. Essink, K., Kotloff, S. Frey, R., Novak, D., Diemert, S.A., Spector, N., Rouphael, C.B., Creech, J., McGettigan, S., Khetan, N., Segall, J., Solis, A., Brosz, C., Fierro, H., Schwartz, K., Neuzil, L., Corey, P., Gilbert, H., Janes, D., Follmann, M., Marovich, J., Mascola, L., Polakowski, J., Ledgerwood, B.S., Graham, H., Bennett, R., Pajon, C., Knightly, B., Leav, W., Deng, H., Zhou, S., Han, M., Ivarsson, J., Miller, T., and Zaks, C. S.. 2021. Group, Efficacy and Safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 Vaccine, N. Engl. J. Med. 384, 403–416.

[0065] Balabanian K., Harriague J., and Decrion C.. 2004. CXCR4-tropic HIV-1 envelope glycoprotein functions as a viral chemokine in unstimulated primary CD4+T lymphocytes. J Immunol. 173: 7150–60.

[0066] Brown C.R., Gupta S., Qin J., Racie T., He G., Lentini S., Malone R., Yu M., Matsuda S., and Shulga-Morskaya S.. 2020. Investigating the pharmacodynamic durability of GalNAc-siRNA conjugates. Nucleic Acids Res. 48: 11827–11844.

[0067] Cameron P. U., Saleh S., and Sallmann G.. 2010. Establishment of HIV-1latency in resting CD4+T cells depends on chemokine-inducedchanges in the actin cytoskeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107: 16934–9.

[0068] Chang, C., Leu, J., and Lee, Y.. 2015. The actin depolymerizing factor (ADF)  / cofilin signaling pathway and DNA damage responses in cancer. Int. J. Mol. Sci. 16, 4095–4120.

[0069] Corey, D.R, Damha M., J., and Manoharan M.. 2022. Challenges and opportunities for nucleic acid therapeutics. Nucleic Acid Ther. 32, 8–13.

[0070] Dowdy SF.. 2017. Overcoming cellular barriers for RNA therapeutics. Nat. Biotechnol. 35: 222–229.

[0071] Dowdy S.F., Setten, R..L., Cui, X. S., and Jadhav, S.G.. 2022. Delivery of RNA therapeutics: the great endosomal escape! . Nucleic Acid Ther. 32, 361–368.

[0072] Dupont, E., Prochiantz, A., and Joliot, A.. 2015. Penetration Story: An Overview. Methods Mol. Bio. 1324, 29–37.

[0073] Ezhevsky, S.A., Nagahara, H., Vocero-Akbani A.M., and Dowdy, S.F.. 1997. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D: Cdk4 / 6 complexes results in active pRb. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10699–10704.

[0074] Gilleron J., William Q., Anja Z., Borodovsky, A., Marsico G., Schubert, U., Manygoats, K., Seifert, S., Andree, C.,  M., Epstein-Barash H., Zhang, L., Koteliansky, V., Fitzgerald, K., Fava, E., Bickle, M., Kalaidzidis, Y., Akinc, A., Maier, M., and Zerial M.. 2013. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31, 638-646.

[0075] Gilleron, J., Querbes, W., Zeigerer, A., Borodovsky, A., Marsico, G., Schubert, U., Manygoats, K., Seifert, S., Andree, C., Salazar, M.A., Kwiatkowski, A.V., Pellegrini, L., Cestra, G., Butler, M.H., Rossman, K.L., Serna, D.M., Sondek, J., Gertler, F.B. and De Camilli, P.. 2003. Tuba, a novel protein containing bin / amphiphysin / Rvs and Dbl homology domains, links dynamin to regulation of the actin cytoskeleton. J. Biol. Chem. 278, 49031-49043.

[0076] Glogau, R., Blitzer A., Brandt, F., Kane, M., Monheit G.D., Waugh J.M.. 2012. Results of a randomized, double-blind, placebo-controlled study to evaluate the efficacy and safety of a botulinum toxin type A topical gel for the treatment of moderate-to-severe lateral canthal lines. J. Drugs Dermatol. 11, 38–45.

[0077] Hammond S.M., Aartsma-Rus A., Alves S., Borgos S.E., Buijsen R.A.M., Collin R.W.J., Covello G., Denti M.A., Desviat L.R., and Echevarría L.. 2021. Delivery of oligonucleotide-based therapeutics: challenges and opportunities. EMBO. Mol. Med. 13: e13243.

[0078] He C., Migawa M.T., Chen K., Weston T.A., Tanowitz M., Song W., Guagliardo P., Iyer K.S., Bennett C.F., and Fong L.G.. 2021. High-resolution visualization and quantification of nucleic acid-based therapeutics in cells and tissues using nanoscale secondary ion mass spectrometry (NanoSIMS) . Nucleic Acid Res. 49, 1–14.

[0079] Hernandez L.D., Hoffman, L.R., Wolfsberg T.G., and White, J.M.. 1996. Virus-cell and cell-cell fusion. Annu Rev Cell Dev. Biol. 12: 627–661.

[0080] Huang T.Y., Minamide L.S., Bamburg J.R., and Bokoch G.M.. 2008.. Chronophin mediates an ATP-sensing mechanism for cofilin dephosphorylation and neuronal cofilin-actin rod formation. Dev. Cell 15, 691–703.

[0081] Huang, L., Kuwahara, I., and Matsumoto, K.. 2014. EWS represses cofilin 1expression by inducing nuclear retention of cofilin 1 mRNA. Oncogene 33, 2995–3003.

[0082] Innocenti, M., Gerboth, S., Rottner, K., Lai, F.P., Hertzog, M., Stradal, T.E., Frittoli, E., Didry, D., Polo, S., and Disanza, A.. 2005. Abi1 regulates the activity of NWASP and WAVE in distinct actin-based processes. Nat. Cell Biol. 7, 969-976.

[0083] Koren, E., and Torchillin, V.P.. 2012. Cell-penetrating peptides: breaking through to the other side. Trends Mol. Med. 18, 385–93.

[0084] Kovacs, E.M., Makar, R.S., and Gertler, F.B.. 2006. Tuba stimulates intracellular NWASP-dependent actin assembly. J. Cell Sci. 119, 2715-2726.

[0085] Kulkarni, J.A., Cullis, P.R., and Meel, R.V.D.. 2018. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: from concepts to clinical utility. Nucleic Acid Ther 28, 146–157.

[0086] Kulkarni, J.A., Witzigmann, D., Chen S., Cullis P.R., and Meel R.V.D.. 2019. Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics. Acc. Chem. Res. 52, 2435–2444.

[0087] Lagache, T., Danos, O., and Holcman, D.. 2012. Modeling thestep of endosomal escape during cell infection by a nonenvelopedvirus. Biophys J 102: 980–989.

[0088] Lappalainen, P., and Drubin, D.G.. 1997. Cofilin promotes rapid actin filament turnover in vivo. Nature 388, 78–82.

[0089] P., Dowdy, S., F.. 2015. Cationic PTD / CPP-mediated macromolecular delivery: charging into the cell. Expert. Opi. Drug Deliv. 12, 1627–1636.

[0090] P., Kacsinta, A.D., Cui, X.S., Hamil A.S., Ksulich, M., Gogoi, K., and Dowdy, S.F.. 2016. Enhancing Endosomal Escape for Intracellular Delivery of Macromolecular Biologic Therapeutics. Sci. Rep. 6, 1-6.

[0091] Merrifield, C.J., Perrais, D. and Zenisek, D.. 2005. Coupling between clathrin-coated pit invagination, cortactin recruitment, and membrane scission observed in live cells. Cell 121, 593-606.

[0092] Nakase, I., Tanaka, G., and Futaki, S.. 2013. Cell-penetrating peptides (CPPs) as a vector for the delivery of siRNAs into cells. Mol. Biosyst. 9, 855–861.

[0093] Polack, F.P., Thomas, S.J.N., Kitchin, J., Absalon, A., Gurtman, S., Lockhart, J.L., Perez, G., Perez Marc, E.D., Moreira, C., Zerbini, R., Bailey, K.A., Swanson, S., Fazi, B., Cope, M., Douangamath, A., Ferracuti, S., Schirwitz, K., Zucconi, A., Drubin, D.G., Wilmanns, M., Cesareni, G., and Castagnoli, L.. 2002. Unusual binding properties of the SH3 domain of the yeast actin-binding protein Abp1–Structural and functional analysis. J. Biol. Chem. 277, 5290-5298.

[0094] Polack, F.P., Thomas, S.J., Kitchin, N., Absalon, J., Gurtman, A., Lockhart, S., Perez, John L., P′erez Marc, G., Moreira, E.D., Zerbini, C., Bailey, R., Swanson, K.A., Roychoudhury, S., Koury, K., Li, P., Kalina, W.V., Cooper, D., Frenck, R.W., Hammitt, L.L., Türeci, ¨O., Nell, H., Schaefer, A.,  S., Tresnan, D.B., Mather, S., Dormitzer, P.R., Sahin, U., Jansen, K.U., and Gruber, W.C.. 2020. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA covid-19 vaccine. N. Engl. J. Med. 383, 2603–2615.

[0095] Pooga, M., Hallberink M., Zorko M., and Langel U.. 1998. Cell penetration by transportation. FASEB J. 12, 67–77.

[0096] Roychoudhury, K., Koury, P., Li, W.V., Kalina, D., Cooper, R.W., Frenck Jr, L.L., Hammitt, O., Tureci, H., Nell, A., Schaefer, S., Unal, D.B., Tresnan, S., Mather, P.R., Dormitzer, U., Sahin, K.U., Jansen, W.C., and Gruber, C.C. T. 2020. Group, Safety and Efficacyof the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine, N. Engl. J. Med. 383, 2603–2615.

[0097] Sahay, G., Querbes, W., Alabi, C., Eltoukhy, A., Sarkar, S., Zurenko, C., Karagiannis, E., Love, K., Chen, D., Zoncu, R., Buganim, Y., Schroeder, A., Langer, R., Anderson, D.G.. 2013. Efficiency of siRNA Delivery by Lipid Nanoparticles Is Limited by Endocytic Recycling. Nat. Biotechnol. 31, 653-658.

[0098] Staring. J., Raaben, M., and Brummelkamp, T.R.. 2018. Viral escape from endosomes and host detection at a glance. J Cell Sci. 131: jcs216259.

[0099] Sauvonnet, N., Dujeancourt, A., and Dautry-Varsat, A.. 2005. Cortactin and dynamin are required for the clathrin-independent endocytosis of gammac cytokine receptor. J. Cell Biol. 168, 155-163.

[0100] Schoenmaker, L., Witzigmann, D., Kulkarni, J.A., Verbeke, R., Kersten, G., Jiskoot, W., Crommelin, D.J.A.. 2021. mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines structure and stability, Int. J. Pharm. 601, 1-13.

[0101] Soosairajah J., Maiti S., Wiggan O., Sarmiere, P., Moussi, N., Sarcevic, B., Sampath, R., Bamburg, J.R., and Bernard, O., 2005. Interplay between components of a novel LIM kinase-slingshot phosphatase complex regulates cofilin. EMBO J. 24, 473–86.

[0102] M., Epstein-Barash, H., Zhang, L., Koteliansky, V., Fitzgerald, K., Fava, E., Bickle, M., Kalaidzidis, Y., Akinc, A., Maier, M.. 2013. Image-Based Analysis of Lipid Nanoparticle-Mediated siRNA Delivery, Intracellular Trafficking and Endosomal Escape. Nat. Biotechnol. 31, 638-646.

[0103] Sun, Y.D., Martin, A.C., Drubin, D.G.. 2006. Endocytic internalization in budding yeast requires coordinated actin nucleation and myosin motor activity. Dev. Cell 11, 33-46.

[0104] Yoder, A., Yu, D., Dong, L., Iyer, S.R., Xu, X., Kelly, J., Liu, J., Wang, W., Vorster, P.J., Agulto, L., Stephany, D.A., Cooper, J.N., Jon W. Marsh, J.W., and Wu Y. 2008. HIV envelope-CXCR4 signaling activates cofilin to overcome cortical actin restriction in resting CD4 T cells. Cell 134, 782–92.

[0105] Wang, W., Eddy, R., and Condeelis, J.. 2007. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat. Rev. Cancer 7, 429–440.

[0106] Zheng K., Kitazato K., Wang Y., and He, Z.. 2016. Pathogenic microbes manipulate cofilin activity to subvert actin Cytoskeleton. Crit. Rev. Microbiol., 42, 677–695.

[0107] Zhu, J., Zhou, K., Hao, J.J., Liu, J., Smith, N., and Zhan, X.. 2005. Regulation of cortactin / dynamin interaction by actin polymerization during the fission of clathrincoated pits. J. Cell Sci. 118, 807-817.

[0108] SEQ ID NO: 1 MASGVAVSDG VIKVFN

[0109] SEQ ID NO: 2 MASGVAVSDG VIAVFN

[0110] SEQ ID NO: 3 MASGVAVSDG VLAVFN

[0111] SEQ ID NO: 4 MASGVAVSDG VIVVFN

[0112] SEQ ID NO: 5 MASGVAVSDG VIALFN

[0113] SEQ ID NO: 6 MASGVAVSDG VIAIFN

[0114] SEQ ID NO: 7 MASGVAVSDG VVIAFN

[0115] SEQ ID NO: 8 MASGVAVSDG VVLAFN

[0116] SEQ ID NO: 9 MASGVAVSDG VILVFN

[0117] SEQ ID NO: 10 MASGVAVSDG VIIVFN

[0118] SEQ ID NO: 11 MASGVAVSDG VIWVFN

[0119] SEQ ID NO: 12 MASGVAVSDG VIFWFN

[0120] SEQ ID NO: 32 MASGVAVSDG VLVVFN

[0121] SEQ ID NO: 13 MASGVAVSDG VIKVFNGGFW FG

[0122] SEQ ID NO: 14 MASGVAVSDG VIAVFNGGFW FG

[0123] SEQ ID NO: 15 MASGVAVSDG VIKVGGFWFG

[0124] SEQ ID NO: 16 MASGVAVSDG VIKVGPFWFG

[0125] SEQ ID NO: 17 MASGVAVSDG VVIAFNGGFW FG

[0126] SEQ ID NO: 18 MASGVAVSDG VILLGPFWFG

[0127] SEQ ID NO: 19 MASGVAVSDG VVLAGPFWFG

[0128] SEQ ID NO: 20 MASGVAVSDG VIKVFNGGFW FGGKRK

[0129] SEQ ID NO: 21 MASGVAVSDG VIKVFNGGFW FGPKRK

[0130] SEQ ID NO: 22 MASGVAVSDG VIAVFNGGFW FGGKRK

[0131] SEQ ID NO: 23 MASGVAVSDG VIAVFNGGFW FGGK

[0132] SEQ ID NO: 24 MASGVAVSDG VIAVFNGPFW FGPKRK

[0133] SEQ ID NO: 25 MASGVAVSDG VIAVFNGPFW FGPK

[0134] SEQ ID NO: 26 MASGVAVSDG VVIAFNGGFW FGGKRK

[0135] SEQ ID NO: 27 MASGVAVSDG VVIAFNGPFW FGGKRK

[0136] SEQ ID NO: 28 MASGVAVSDG VIAVFNK

[0137] SEQ ID NO: 29 MASGVAVSDG VIAVFNR

[0138] SEQ ID NO: 30 MASGVAVSDG VIAVFGK

[0139] SEQ ID NO: 31 MASGVAVSDG VIAVFGR

Claims

1.A method of enhancing liquid nanoparticles cell transfection, comprising:providing a therapeutical agent;providing a delivery vector, the delivery vector being liquid nanoparticles, comprising a peptide derived from human cofilin, and transporting the therapeutical agent to target cells; andreleasing the therapeutical agent in the target cells.2.The method of claim 1, wherein the therapeutical agent is messenger RNAs (mRNAs) , small interfering RNAs (siRNAs) , or antisense oligonucleotides (ASOs) .3.The method of claim 1 or 2, wherein the peptide comprises SEQ ID NO: 1; or a sequence that has at least 81.25%identity to SEQ ID NO: 1 and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1.4.The method of any one of claims 1-3, wherein the peptide comprises an N-terminus portion and a C-terminus portion; the N-terminus portion comprises SEQ ID NO: 1, or comprises a sequence that has at least 81.25%identity to SEQ ID NO: 1 and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1; and the C-terminus portion comprises at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine and tryptophan and at least one amino acid selected from the group consisting of glycine, leucine, isoleucine, and valine.5.The method of any one of claims 1-4, wherein the peptide comprises an N-terminus portion and a C-terminus portion; the N-terminus portion comprises SEQ ID NO: 1, or comprises a sequence that has at least 81.25%identity to SEQ ID NO: 1 and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1; and the C-terminus portion comprises at least one amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine, and histidine.6.The method of any one of claims 1-5, wherein the peptide further comprises a middle portion, wherein the middle portion is located between the N-terminus portion and the C-terminus portion; and middle portion comprises at least one amino acid selected from the group consisting of at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine and tryptophan.7.The method of any one of claims 1-6, wherein the delivery vector further comprises an ionizable cationic lipid, 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , cholesterol, and a polyethylene glycol (PEG) -lipid conjugate.8.A peptide comprising a sequence that has at least 81.25%identity to SEQ ID NO: 1, and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1.9.The peptide of claim 8, wherein the peptide contains three substitution modifications relative to SEQ ID NO: 1.10.The peptide of claim 8 or 9, wherein the peptide comprising a sequence that has at least 87.5%identity to SEQ ID NO: 1, and contains two substitution modifications relative to SEQ ID NO: 1.11.The peptide of any one of claims 8-10, wherein the peptide comprising a sequence that has at least 93.75%identity to SEQ ID NO: 1, and contains one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1.12.The peptide of any one of claims 8-11, wherein the peptide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12.13.A peptide comprising an N-terminus portion and a C-terminus portion, wherein the N-terminus portion comprises SEQ ID NO: 1, or comprises a sequence that has at least 81.25%identity to SEQ ID NO: 1 and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1; and the C-terminus portion comprises at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine and tryptophan and at least one amino acid selected from the group consisting of glycine, leucine, isoleucine, and valine.14.The peptide of claim 13, wherein the peptide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 19.15.A peptide comprising an N-terminus portion and a C-terminus portion, wherein the N-terminus portion comprises SEQ ID NO: 1, or comprises a sequence that has at least 81.25%identity to SEQ ID NO: 1 and contains at least one substitution modification relative to SEQ ID NO: 1; and the C-terminus portion comprises at least one amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine, and histidine.16.The peptide of claim 15, further comprising a middle portion, wherein the middle portion is located between the N-terminus portion and the C-terminus portion; and middle portion comprises at least one amino acid selected from the group consisting of at least one amino acid selected from the group consisting of phenylalanine and tryptophan.17.The peptide of claim 15 or 16, wherein the peptide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, and SEQ ID NO: 31.

Images